Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

ELABORATION AND VALIDATION OF METHODIC DETERMINATION IMPURITY IN SUBSTANCE OF AMIDE N-ALLYLANTHRANYLIC ACID

Karpenko Yu.N. 1 Bass S.M. 1 Yarygina T.I. 1
1 «The Perm state pharmaceutical academy» Ministry of Health of Russian Federation
New biologically active substance amide N-allylanthranylic acid (АNААA) was synthesized. The impurity (the initial product of synthesis) - amid anthranylic acid (AAA) was determine by reserve phase HPLC. The analysis performed on C18 column (25сm×4,6mm, sorbent Discovery® С18, 5 µm particle size). Mobile phase: acetonitrile / 0,1% solution of trifluoroacetic acid (30:70 v/v), the flow rate of mobile phase – 1 ml/min, the wave length of detection – 212 nm, the volume of pumped sample - 20 µl, the temperature of column – 40 °С. Linearity of elaborated methodic determined on the five levels of concentration in the range of 0,05-0,5% from the content of active substance - АNААA. The limit of detection and limit of quantitation of AAA were 0,5 µg/ml и 1 µg/ml, respectively. Evaluation repeatability of methodic conducted in the range of 1-10 µg/ml. The relative standard deviation (RSD) was no more than 10%.The determination of accuracy conducted on the three levels of concentration AAA in АNААA (0,05, 0,1 and 0,5%). Limit of recovery of AAA don’t get out from 75 – 125% which recommended to quantitation the impurity with standard of content from 0,1 to 1%.
reserve phase HPLC
validation
amid anthranylic acid
amide N-allylanthranylic acid

Введение

В результате поиска биологически активных соединений в ряду амидов
N-замещенных антраниловых кислот [4; 5] выявлено соединение, проявившее наибольший противовоспалительный эффект – амид N–аллилантраниловой кислоты (АNААК). В связи с рекомендацией к проведению доклинических испытаний нами проводятся исследования по разработке методов контроля качества и стандартизации субстанции и лекарственных форм этого соединения [1].

Исходя из схемы получения АNААК, посторонней (специфической) примесью в его субстанции может быть амид антраниловой кислоты (ААК).

Целью настоящей работы явилась разработка и валидация методики определения посторонней примеси ААК в субстанции АNААК методом обращённо-фазной ВЭЖХ.

Материалы и методы исследования

В исследованиях использовался высокоэффективный жидкостный хроматограф «Shimadzu LC Prominence» (Япония), оснащённый колонкой из нержавеющей стали (25 см×4,6 мм, сорбент Discovery® С18 с размером частиц 5 мкм) и диодноматричным детектором.

Для приготовления подвижных фаз использовали воду бидистиллированную, фосфорную кислоту концентрированную, трифторуксусную кислоту, ацетонитрил для хроматографии, метанол [3].

В работе использовали пять серий субстанции АNААК, синтезированные на кафедре фармацевтической химии ФОО ПГФА в 2008-2012 гг., ААК марки Lancaster Synthesis.

Результаты исследований и их обсуждение

Предварительный эксперимент показал, что оптимальным элюентом с точки зрения эффективного разделения аналитов, а также симметрии хроматографических пиков является подвижная фаза на основе ацетонитрила и 0,1%-ного раствора трифторуксусной кислоты в соотношении 30:70. УФ-спектры АNААК в 0,1 М растворе хлористоводородной кислоты характеризуются тремя максимумами поглощения 216 нм, 257 нм и 350 нм (Е1%1см соответственно 1520, 520 и 320) [2]. Длину волны детектирования (212 нм) выбирали, исходя из полученного спектра ААК в подвижной фазе (рис. 1). Хроматограмма раствора модельной смеси АNААК и ААК (по 200 мкг/мл) в элюенте представлена на рис. 2.

Разработанные условия хроматографического анализа:

- подвижная фаза: ацетонитрил – 0,1%-ный раствор трифторуксусной кислоты (30:70);

- скорость потока подвижной фазы – 1 мл/мин;

- длина волны детектирования – 212 нм;

- объем вводимой пробы – 20 мкл;

- температура термостата колонки – 40 °С.

 

Рис. 1. УФ-спектр ААК в подвижной фазе ацетонитрил – 0,1%-ный раствор трифторуксусной кислоты (30:70).

 

Рис. 2. Хроматограмма раствора модельной смеси АNААК и ААК (длина волны детектирования 212 нм).

Валидацию аналитической методики проводили по параметрам: специфичность, линейность, правильность, повторяемость (сходимость), предел обнаружения и предел количественного определения.

При подтверждении специфичности использовали модельную смесь субстанции АNААК (1 мг/мл) и примеси ААК (10 мкг/мл) в подвижной фазе (рис. 3).

Рис. 3. Хроматограмма модельной смеси АNААК (1 мг/мл) и примеси ААК (10 мкг/мл) в подвижной фазе.

Идентификацию ААК и АNААК на хроматограмме осуществляли путем сопоставления времён удерживания аналитов и стандартных образцов. Пик ААК в разработанных условиях имеет время удерживания 3,20 ±0,05 мин, пик АNААК – 6,72±0,05 мин. Анализ «холостой» хроматограммы (растворителя образца) показал отсутствие мешающих посторонних пиков. Коэффициент разрешения (Rs) пика примеси и основного вещества составил 5,4, что свидетельствует о хорошем разделении (рекомендуемое значение Rs при определении содержания примесей больше 2). Коэффициент асимметрии пика ААК, характеризующий надежность определения границ пика, равен 1,1 (рекомендуемое значение – от 0,8 до 1,5). Относительное стандартное отклонение (RSD) площадей пиков ААК для трёх последовательных хроматограмм составило 1,92%.

Линейность методики определяли на пяти уровнях концентраций ААК в подвижной фазе (0,05; 0,1; 0,25; 0,35; 0,5% от содержания основного вещества – субстанции АNААК). Для этого в мерные колбы вместимостью 25 мл помещали раствор ААК в метаноле с концентрацией 53,5 мкг/мл (0,5, 1,0, 2,5, 3,5 и 5,0 мл) и доводили объем колб метанолом до метки. Коэффициент корреляции составил 0,999, что свидетельствует о линейности методики в выбранном диапазоне концентраций (рис. 4).

Рис. 4. Зависимость площади пика от концентрации ААК (мкг/мл) в модельных смесях.

Предел обнаружения ААК по предложенной методике составляет 0,5 мкг/мл (0,025% от содержания в субстанции АNААК), предел количественного определения 1 мкг/мл (0,05% от содержания в субстанции АNААК).

Оценку повторяемости методики проводили на модельных растворах ААК на четырех уровнях концентраций: 1, 2, 5 и 10 мкг/мл, что соответствует 0,05; 0,1; 0,25 и 0,5% от содержания в субстанции АNААК. Каждый из растворов готовился в соответствии с тестируемой методикой и хроматографировался не менее 3 раз.

Относительное стандартное отклонение не превышает 10,0%, что свидетельствует об удовлетворительной сходимости результатов на всех уровнях рассматриваемых концентраций (табл. 1).

Таблица 1 – Оценка повторяемости (сходимости) методики определения ААК

Содержание ААК в растворе, мкг/мл

Найденное содержание ААК, мкг/мл

Метрологические характеристики

(P =0,95; n=6)

n

SD

RSD

ΔX

1

0,79; 0,87; 0,91;

0,78; 0,89;0,84

6

0,85

0,053

6,23

0,14

2

2,03; 1,93; 1,95;

2,04; 1,98; 1,95

6

1,98

0,046

2,32

0,12

5

4,84; 5,10; 4,90;

4,89; 5,06; 4,86

6

4,94

0,110

2,22

0,28

10

9,82; 9,88; 10,11;

10,07; 9,93; 9,78

6

9,93

0,133

1,34

0,34

При определении правильности методики (табл. 2) оценивали открываемость известного количества аналита (ААК), введенного в плацебо (субстанцию АNААК). Исследования проведены на трех уровнях содержания ААК в АNААК (0,05, 0,1 и 0,5%). По 0,05 г субстанции АNААК помещали в мерные колбы вместимостью 25 мл, растворяли в 10 мл метанола, добавляли в каждую колбу раствор ААК в метаноле с концентрацией 50 мкг/мл (0,5, 1,0, 5,0 мл) и доводили объем колб метанолом до метки.

Таблица 2 – Оценка правильности методики определения ААК

Содержание ААК в растворе, мкг/мл

Открываемость

(R), %

Метрологические характеристики

(P =0,95; n=6)

n

SD

RSD

Δ

1

92,4; 83,6; 102,0;

93,1; 88,2; 96,1

6

92,3

5,83

6,31

6,11

2

94,5; 103,5; 103,0;

97,0; 94,0; 98,5

6

98,42

4,09

4,15

4,29

10

98,8; 99,7; 102,1;

99,1; 101,4; 99,7

6

100,13

1,32

1,32

1,38

Границы открываемости ААК не выходят за пределы 75–125%, рекомендованные при количественном определении примесей с нормой содержания от 0,1 до 1%.

Анализ пяти серий субстанции АNААК показал, что содержание в них посторонней примеси ААК не превышает 0,1%.

Разработанная методика включена в проект ФС на субстанцию АNААК.

Выводы

1. Установлены условия определения примеси ААК в субстанции АNААК методом обращённо-фазной ВЭЖХ.

2. Валидация разработанной методики по параметрам специфичность, линейность, предел обнаружения и предел количественного определения, повторяемость (сходимость), правильность показала её приемлемость для определения 0,05-0,5% примеси ААК в субстанции АNААК.

Рецензенты:

Вихарева Елена Владимировна, доктор фармацевтических наук, доцент, заведующий кафедрой аналитической химии ГБОУ ВПО «ПГФА» Минздрава России, г. Пермь.

Гейн Владимир Леонидович, доктор химических наук, профессор, заведующий кафедрой физической и коллоидной химии ГБОУ ВПО «ПГФА» Минздрава России, г. Пермь.