Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,791

РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЕСКВИТЕРПЕНОВЫХ ЛАКТОНОВ В ТРАВЕ СОССЮРЕИ ГОРЬКОЙ

Погодин И.С. 1 Лукша Е.А. 1
1 ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» Минздрав России
В настоящее время внедрение в медицинскую практику нового лекарственного растительного сырья требует разработки методики количественного определения действующих веществ, соответствующей современным требованиям и прошедшей валидацию согласно рекомендациям ICH (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use – Международная конференция по гармонизации технических требований к регистрации лекарственных средств для применения у человека). В статье представлены экспериментальные исследования по разработке методики количественного определения сесквитерпеновых лактонов методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в траве соссюреи горькой. Проведена валидация методики по следующим критериям: специфичность, линейность, прецизионность (воспроизводимость) и точность. Установлено, что предложенная методика является специфичной, линейной в аналитической области, точной и прецизионной. Полученные результаты будут включены в проект фармакопейной статьи «Соссюреи горькой трава».
валидация
ВЭЖХ
соссюрея горькая
1. Биологическая активность Saussurea amara / Л.Д. Модонова [и др.] // Химико-фармацевтический журнал. – 1986. – № 12. – С. 1472-1475.
2. Вичканова С.А. Антимикробная активность видов рода Saussurea DC. / С. А. Вичканова, М. А. Рубинчик, А. И. Шретер // Растительные ресурсы. – 1969. – Т. 5. Вып. 2. – С. 224-229.
3. ГОСТ Р ИСО 5725-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений» : в 6 ч. – Введ. 23.04.02. – М. : Госстандарт России; Изд-во стандартов, 2002.
4. Краснов Е.А. Флора Сибири – источник биологически активных веществ и лекарственных средств // Бюллетень сибирской медицины. Приложение 2. – 2006. – Т. 5. – С. 11-18.
5. Руководство по валидации методик анализа лекарственных средств / под ред. Н.В. Юргеля [и др.]. – М. : Фармацевтическая промышленность, 2007. – 58 с.
6. Серых Г.И. Saussurea DC. – Соссюрея, Горькуша. / Г.И. Серых, О.С. Жирова, И.М. Красноборов // Флора Сибири. Т. 13: Asteraceae (Compositae). – Новосибирск : Наука, 1997. – С. 180-209.
7. Фитохимическое исследование надземной части соссюреи горькой (Saussurea amara L.) / И.С. Погодин [и др.] // Омский научный вестник. Сер. «Ресурсы Земли. Человек». – 2010. – № 1 (94). – С. 115-118.
8. Эпштейн Н.А. Оценка пригодности (валидации) ВЭЖХ-методик в фармацевтическом анализе (обзор) // Хим.-фарм. ж. – 2004. – Т. 38. – № 4. – С. 40-56.
9. Choleretic Effects of the Mongolian Medicinal Plant Saussurea amara in the Isolated Perfused Rat Liver / Glasl S. [other] // Planta Med. – 2007. – № 73 (1) – P. 59-66.
10. ICH Q2B / Validation of analytical procedure: Methodology // International Conference for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use. – Geneva, 1996. – 75 c.

Соссюрея горькая (Saussurea amara (L.) DC.) – лекарственное растение из семейства сложноцветных (Compositae), произрастающее на территории Сибири и Дальнего Востока [6]. В народной медицине и скрининговых фармакологических исследованиях обнаружена туберкулоцидная, антипротозойная, противоопухолевая, антибактериальная, желчегонная активность [1; 2; 9]. Таким образом, перспективность внедрения в медицинскую практику нового растительного лекарственного сырья «Соссюреи горькой трава» как противоописторхозного средства не вызывает сомнений.

Фитохимические исследования надземной части соссюреи горькой показали, что одной из действующих групп биологически активных веществ (БАВ) являются сесквитерпеновые лактоны, обладающие антипаразитарной (противоописторхозной и противолямблиозной) активностью [4].

Для использования надземной части соссюреи горькой в качестве лекарственного растительного сырья необходимо разработать нормативную документацию, регламентирующую показатели подлинности и доброкачественности нового лекарственного растительного сырья.

Одним из важнейших показателей доброкачественности является количественное определение действующих групп БАВ.

Введение новой методики количественного определения обязательно предполагает проведение целого комплекса валидационных исследований согласно рекомендациям ICH (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use – Международная конференция по гармонизации технических требований к регистрации лекарственных средств для применения у человека) [5; 10].

Из всего вышесказанного следует, что целью нашей работы являлась разработка методики количественного определения сесквитерпеновых лактонов в траве соссюреи горькой.

Материалы и методы

Для разработки методики количественного определения сесквитерпеновых лактонов использовали 10 образцов сырья травы соссюреи горькой, собранных в период 2010–2011 гг. в фазу массового цветения на территории Новосибирской, Тюменской, Курганской и Омской областей в пределах естественного ареала растения. Сушку сырья производили воздушно-теневым способом.

Для разработки методики количественного определения использовали метод обращенно-фазовой ВЭЖХ высокого давления на приборе Shimadzu LC-20 Prominence в изократическом режиме в следующих условиях:

· аналитическая колонка, заполненная сорбентом PerfectSil 300 ODS C18, 4,6 х 250 мм, с размером частиц 5 мкм;

· состав подвижной фазы: метанол – вода в соотношении 50:50;

· детектирование при длине волны 204 нм;

· температура колонки – комнатная;

· скорость подвижной фазы 0,5 мл/мин;

· объем вводимой пробы 20 мкл.

Количественное содержание сесквитерпеновых лактонов в исследуемых образцах в процентах определяют методом сравнения со стандартным образцом (СО).

Обработку результатов производили с использованием программного обеспечения LC Solutions.

Результаты и их обсуждение

Проведенные ранее фитохимические исследования [7] комплекса сесквитерпеновых лактонов соссюреи горькой показали, что содержащиеся в растении сесквитерпеновые лактоны, относятся к группе гваянолидов – гроссгемин, репин и цинаропикрин, из которых преобладающим является цинаропикрин.

Таким образом, опираясь на данные ВЭЖХ-анализа, можно сделать вывод о необходимости при разработке методик количественного определения сесквитерпеновых лактонов методом ВЭЖХ делать пересчет на доминирующее вещество – цинаропикрин.

Методика: около 0,100 г (точная навеска) травы соссюреи горькой трижды экстрагируют смесью хлороформ – спирт этиловый в соотношении 4:1 при нагревании. Растворитель удаляют на ротационном испарителе. К сухому остатку приливают 10 мл подвижной фазы, растворяют при нагревании на водяной бане, охлаждают и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл. Доводят объем раствора до метки тем же растворителем и перемешивают. 0,02 мл раствора вводят в хроматограф.

Приготовление стандартного образца: около 0,005 г (точная навеска) СО цинаропикрина помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, приливают 10 мл подвижной фазы, нагревают на водяной бане до полного растворения образца и охлаждают. Доводят объем раствора до метки растворителем и перемешивают. 0,02 мл раствора вводят в хроматограф.

Содержание цинаропикрина Х (%) в пересчете на массу сырья в траве соссюреи горькой вычисляют по формуле:

где So – площадь пика на хроматограмме раствора СО цинаропикрина (по данным LC Solutions);

S – площадь пика цинаропикрина на хроматограмме испытуемого раствора (по данным LC Solutions);

mo – навеска СО цинаропикрина, в г;

m – навеска сырья соссюреи горькой, в г;

W – потеря в массе при высушивании сырья, в %;

Р – содержание цинаропикрина в стандартном образце цинаропикрина, в %.

По результатам количественного определения сесквитерпеновых лактонов методом обращенно-фазовой ВЭЖХ было установлено, что содержание сесквитерпеновых лактонов в пересчете на цинаропикрин в надземной части соссюреи горькой составляет 0,608±0,024% (табл. 1).

Таблица 1 – Метрологическая характеристика метода количественного определения сесквитерпеновых лактонов в соссюреи горькой

n

Xср

S2

S

Sr

t (0,95)

X ± Δх

10

0,608

0,55×10-4

6,7×10-3

1,1×10-2

2,26

0,608 ± 0,024

Важнейшим критерием оценки аналитической методики служит доказательство ее валидности, включающей взаимосвязанную систему характеристик: специфичность, линейность, прецизионность (воспроизводимость) и точность [5; 10].

Специфичность. Идентификация цинаропикрина подтверждалась совпадением времени удерживания анализируемого компонента и СО цинаропикрина (рис. 1, 2). Пики сопутствующих и родственных соединений, входящих в состав извлечения соссюреи горькой, хорошо разделяются с пиком цинаропикрина, время удерживания которого 11,25 мин, и не влияют на аналитическое определение.

Рис. 1. Хроматограмма стандартного образца цинаропикрина: по оси абсцисс – время удерживания, мин; по оси ординат – высота пика, mAU. 

 

Рис. 2. Хроматограмма извлечения соссюреи горькой (цинаропикрин tR=11,25): по оси абсцисс – время удерживания, мин; по оси ординат – высота пика, mAU

Линейность и аналитическая область методики была подтверждена анализом 7 проб разных концентраций в диапазоне от 70 до 130% от концентрации, принятой за 100% [8]. Сравнение зависимости между содержанием цинаропикрина (мг/мл) в испытуемых растворах и величинами площадей хроматографических пиков показало, что она имеет линейный характер. Результаты исследований представлены в таблице 2, графическая зависимость отражена на графике (рис. 3).

Таблица 2 – Результаты определения линейности методики

№ п/п

Концентрация цинаропикрина, мг/мл

Площадь пика цинаропикрина,

mAU

1

0,425

469,99

2

0,485

537,13

3

0,544

604,27

4

0,612

671,41

5

0,670

738,55

6

0,733

805,69

7

0,786

872,84

mAU
 мг/мл

Рис. 3. Градуировочный график зависимости площадей хроматографических пиков от содержания цинаропикрина в траве соссюреи горькой: по оси абсцисс (x) – концентрация, мг/мл; по оси ординат (y) – высота пика, mAU.

Установлено, что в заданной области концентраций сесквитерпеновых лактонов в траве соссюреи горькой график имеет линейный характер и описывается уравнением y=1101,97·Х+1,57. Коэффициент корреляции (r) равен 0,999, что позволяет использовать данную методику для количественного определения сесквитерпеновых лактонов в траве соссюреи горькой в данном диапазоне концентраций.

Для установления прецизионности (воспроизводимости) проводили 7 параллельных определений, затем вычисляли величину стандартного отклонения (SD) и относительного стандартного отклонения (RSD) (табл. 3).

Таблица 3 – Результаты определения прецизионности методики.

№ п/п

Найденное содержание сесквитерпеновых лактонов, %

[]x10-6

Метрологические характеристики

1

0,606

-0,002

4

=0,608 %

SD=0,087

RSD=1,25 %

2

0,618

0,010

100

3

0,605

-0,003

9

4

0,621

0,013

169

5

0,597

-0,011

121

6

0,601

-0,007

49

7

0,606

-0,002

4

В разработанной методике величина относительного стандартного отклонения менее 5%, что характеризует надежность анализа в выбранных условиях [3].

Для определения точности методики проанализировали 9 образцов травы соссюреи горькой на 3 уровнях концентраций в пределах аналитической области. Для оценки полученных результатов использовали открываемость (R), которая, согласно требованиям нормативной документации, должна находиться в пределах ±2% [3].

В результате получены 9 значений открываемости, для которых вычисляли величину стандартного отклонения (SD) и относительного стандартного отклонения (RSD) (табл. 4).

Таблица 4 – Результаты определения точности методики определения сесквитерпеновых лактонов в траве соссюреи горькой

№ п/п

Уровень

Навеска сырья,

в г

Найденное

содержание СЛ,

%

Расчетное

содержание СЛ,

%

Открываемость

(R), %

Метрологические

характеристики

1

1

0,0511

0,312

0,311

100,32

0,56

0,3136

=99,76%

SD=0,439

RSD=0,440 %

2

1

0,0508

0,311

0,311

100

0,24

0,0576

3

1

0,0496

0,310

0,311

99,68

-0,08

0,0064

4

2

0,1042

0,605

0,607

99,67

-0,09

0,0081

5

2

0,1037

0,604

0,607

99,51

-0,25

0,0625

6

2

0,1046

0,607

0,607

100

0,24

0,0576

7

3

0,1512

0,901

0,901

100

0,24

0,0576

8

3

0,1497

0,890

0,901

98,78

-0,98

0,9604

9

3

0,1518

0,900

0,901

99,89

0,13

0,0169

Результаты определения точности методики показали, что теоретические и экспериментальные значения количественного содержания сесквитерпеновых лактонов в траве соссюреи практически полностью совпадают. Величина относительного стандартного отклонения (RSD) не превышает 5%, а открываемость R составляет 99,76%, что характеризует точность методики как удовлетворительную.

Установлено, что предлагаемая методика количественного определения сесквитерпеновых лактонов методом ВЭЖХ в траве соссюреи горькой является специфичной, воспроизводимой и точной, что предполагает рекомендовать данную методику при контроле качества лекарственного растительного сырья «Соссюреи горькой трава».

Рецензенты:

Гришин А.В. д. фарм. н., профессор, зав. кафедрой фармации ГБОУ ВПО ОмГМА Минздрава России, г. Омск.

Пеньевская Н.А. д. мед. н., доцент, зав. кафедрой фармацевтической технологии с курсом биотехнологии ГБОУ ВПО «ОмГМА» Минздрава России, г. Омск.


Библиографическая ссылка

Погодин И.С., Лукша Е.А. РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЕСКВИТЕРПЕНОВЫХ ЛАКТОНОВ В ТРАВЕ СОССЮРЕИ ГОРЬКОЙ // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 1.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=8426 (дата обращения: 12.12.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074