Соссюрея горькая (Saussurea amara (L.) DC.) – лекарственное растение из семейства сложноцветных (Compositae), произрастающее на территории Сибири и Дальнего Востока [6]. В народной медицине и скрининговых фармакологических исследованиях обнаружена туберкулоцидная, антипротозойная, противоопухолевая, антибактериальная, желчегонная активность [1; 2; 9]. Таким образом, перспективность внедрения в медицинскую практику нового растительного лекарственного сырья «Соссюреи горькой трава» как противоописторхозного средства не вызывает сомнений.
Фитохимические исследования надземной части соссюреи горькой показали, что одной из действующих групп биологически активных веществ (БАВ) являются сесквитерпеновые лактоны, обладающие антипаразитарной (противоописторхозной и противолямблиозной) активностью [4].
Для использования надземной части соссюреи горькой в качестве лекарственного растительного сырья необходимо разработать нормативную документацию, регламентирующую показатели подлинности и доброкачественности нового лекарственного растительного сырья.
Одним из важнейших показателей доброкачественности является количественное определение действующих групп БАВ.
Введение новой методики количественного определения обязательно предполагает проведение целого комплекса валидационных исследований согласно рекомендациям ICH (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use – Международная конференция по гармонизации технических требований к регистрации лекарственных средств для применения у человека) [5; 10].
Из всего вышесказанного следует, что целью нашей работы являлась разработка методики количественного определения сесквитерпеновых лактонов в траве соссюреи горькой.
Материалы и методы
Для разработки методики количественного определения сесквитерпеновых лактонов использовали 10 образцов сырья травы соссюреи горькой, собранных в период 2010–2011 гг. в фазу массового цветения на территории Новосибирской, Тюменской, Курганской и Омской областей в пределах естественного ареала растения. Сушку сырья производили воздушно-теневым способом.
Для разработки методики количественного определения использовали метод обращенно-фазовой ВЭЖХ высокого давления на приборе Shimadzu LC-20 Prominence в изократическом режиме в следующих условиях:
· аналитическая колонка, заполненная сорбентом PerfectSil 300 ODS C18, 4,6 х 250 мм, с размером частиц 5 мкм;
· состав подвижной фазы: метанол – вода в соотношении 50:50;
· детектирование при длине волны 204 нм;
· температура колонки – комнатная;
· скорость подвижной фазы 0,5 мл/мин;
· объем вводимой пробы 20 мкл.
Количественное содержание сесквитерпеновых лактонов в исследуемых образцах в процентах определяют методом сравнения со стандартным образцом (СО).
Обработку результатов производили с использованием программного обеспечения LC Solutions.
Результаты и их обсуждение
Проведенные ранее фитохимические исследования [7] комплекса сесквитерпеновых лактонов соссюреи горькой показали, что содержащиеся в растении сесквитерпеновые лактоны, относятся к группе гваянолидов – гроссгемин, репин и цинаропикрин, из которых преобладающим является цинаропикрин.
Таким образом, опираясь на данные ВЭЖХ-анализа, можно сделать вывод о необходимости при разработке методик количественного определения сесквитерпеновых лактонов методом ВЭЖХ делать пересчет на доминирующее вещество – цинаропикрин.
Методика: около 0,100 г (точная навеска) травы соссюреи горькой трижды экстрагируют смесью хлороформ – спирт этиловый в соотношении 4:1 при нагревании. Растворитель удаляют на ротационном испарителе. К сухому остатку приливают 10 мл подвижной фазы, растворяют при нагревании на водяной бане, охлаждают и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл. Доводят объем раствора до метки тем же растворителем и перемешивают. 0,02 мл раствора вводят в хроматограф.
Приготовление стандартного образца: около 0,005 г (точная навеска) СО цинаропикрина помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, приливают 10 мл подвижной фазы, нагревают на водяной бане до полного растворения образца и охлаждают. Доводят объем раствора до метки растворителем и перемешивают. 0,02 мл раствора вводят в хроматограф.
Содержание цинаропикрина Х (%) в пересчете на массу сырья в траве соссюреи горькой вычисляют по формуле:
где So – площадь пика на хроматограмме раствора СО цинаропикрина (по данным LC Solutions);
S – площадь пика цинаропикрина на хроматограмме испытуемого раствора (по данным LC Solutions);
mo – навеска СО цинаропикрина, в г;
m – навеска сырья соссюреи горькой, в г;
W – потеря в массе при высушивании сырья, в %;
Р – содержание цинаропикрина в стандартном образце цинаропикрина, в %.
По результатам количественного определения сесквитерпеновых лактонов методом обращенно-фазовой ВЭЖХ было установлено, что содержание сесквитерпеновых лактонов в пересчете на цинаропикрин в надземной части соссюреи горькой составляет 0,608±0,024% (табл. 1).
Таблица 1 – Метрологическая характеристика метода количественного определения сесквитерпеновых лактонов в соссюреи горькой
|
n |
Xср |
S2 |
S |
Sr |
t (0,95) |
X ± Δх |
|
10 |
0,608 |
0,55×10-4 |
6,7×10-3 |
1,1×10-2 |
2,26 |
0,608 ± 0,024 |
Важнейшим критерием оценки аналитической методики служит доказательство ее валидности, включающей взаимосвязанную систему характеристик: специфичность, линейность, прецизионность (воспроизводимость) и точность [5; 10].
Специфичность. Идентификация цинаропикрина подтверждалась совпадением времени удерживания анализируемого компонента и СО цинаропикрина (рис. 1, 2). Пики сопутствующих и родственных соединений, входящих в состав извлечения соссюреи горькой, хорошо разделяются с пиком цинаропикрина, время удерживания которого 11,25 мин, и не влияют на аналитическое определение.
Рис. 1. Хроматограмма стандартного образца цинаропикрина: по оси абсцисс – время удерживания, мин; по оси ординат – высота пика, mAU.
Рис. 2. Хроматограмма извлечения соссюреи горькой (цинаропикрин tR=11,25): по оси абсцисс – время удерживания, мин; по оси ординат – высота пика, mAU
Линейность и аналитическая область методики была подтверждена анализом 7 проб разных концентраций в диапазоне от 70 до 130% от концентрации, принятой за 100% [8]. Сравнение зависимости между содержанием цинаропикрина (мг/мл) в испытуемых растворах и величинами площадей хроматографических пиков показало, что она имеет линейный характер. Результаты исследований представлены в таблице 2, графическая зависимость отражена на графике (рис. 3).
Таблица 2 – Результаты определения линейности методики
|
№ п/п |
Концентрация цинаропикрина, мг/мл |
Площадь пика цинаропикрина, mAU |
|
1 |
0,425 |
469,99 |
|
2 |
0,485 |
537,13 |
|
3 |
0,544 |
604,27 |
|
4 |
0,612 |
671,41 |
|
5 |
0,670 |
738,55 |
|
6 |
0,733 |
805,69 |
|
7 |
0,786 |
872,84 |
mAU
мг/мл
Рис. 3. Градуировочный график зависимости площадей хроматографических пиков от содержания цинаропикрина в траве соссюреи горькой: по оси абсцисс (x) – концентрация, мг/мл; по оси ординат (y) – высота пика, mAU.
Установлено, что в заданной области концентраций сесквитерпеновых лактонов в траве соссюреи горькой график имеет линейный характер и описывается уравнением y=1101,97·Х+1,57. Коэффициент корреляции (r) равен 0,999, что позволяет использовать данную методику для количественного определения сесквитерпеновых лактонов в траве соссюреи горькой в данном диапазоне концентраций.
Для установления прецизионности (воспроизводимости) проводили 7 параллельных определений, затем вычисляли величину стандартного отклонения (SD) и относительного стандартного отклонения (RSD) (табл. 3).
Таблица 3 – Результаты определения прецизионности методики.
|
№ п/п |
Найденное содержание сесквитерпеновых лактонов, % |
|
[ |
Метрологические характеристики |
|
1 |
0,606 |
-0,002 |
4 |
SD=0,087 RSD=1,25 % |
|
2 |
0,618 |
0,010 |
100 |
|
|
3 |
0,605 |
-0,003 |
9 |
|
|
4 |
0,621 |
0,013 |
169 |
|
|
5 |
0,597 |
-0,011 |
121 |
|
|
6 |
0,601 |
-0,007 |
49 |
|
|
7 |
0,606 |
-0,002 |
4 |
]x10-6
=0,608 %
В разработанной методике величина относительного стандартного отклонения менее 5%, что характеризует надежность анализа в выбранных условиях [3].
Для определения точности методики проанализировали 9 образцов травы соссюреи горькой на 3 уровнях концентраций в пределах аналитической области. Для оценки полученных результатов использовали открываемость (R), которая, согласно требованиям нормативной документации, должна находиться в пределах ±2% [3].
В результате получены 9 значений открываемости, для которых вычисляли величину стандартного отклонения (SD) и относительного стандартного отклонения (RSD) (табл. 4).
Таблица 4 – Результаты определения точности методики определения сесквитерпеновых лактонов в траве соссюреи горькой
|
№ п/п |
Уровень |
Навеска сырья, в г |
Найденное содержание СЛ, % |
Расчетное содержание СЛ, % |
Открываемость (R), % |
|
|
Метрологические характеристики |
|
1 |
1 |
0,0511 |
0,312 |
0,311 |
100,32 |
0,56 |
0,3136 |
SD=0,439 RSD=0,440 % |
|
2 |
1 |
0,0508 |
0,311 |
0,311 |
100 |
0,24 |
0,0576 |
|
|
3 |
1 |
0,0496 |
0,310 |
0,311 |
99,68 |
-0,08 |
0,0064 |
|
|
4 |
2 |
0,1042 |
0,605 |
0,607 |
99,67 |
-0,09 |
0,0081 |
|
|
5 |
2 |
0,1037 |
0,604 |
0,607 |
99,51 |
-0,25 |
0,0625 |
|
|
6 |
2 |
0,1046 |
0,607 |
0,607 |
100 |
0,24 |
0,0576 |
|
|
7 |
3 |
0,1512 |
0,901 |
0,901 |
100 |
0,24 |
0,0576 |
|
|
8 |
3 |
0,1497 |
0,890 |
0,901 |
98,78 |
-0,98 |
0,9604 |
|
|
9 |
3 |
0,1518 |
0,900 |
0,901 |
99,89 |
0,13 |
0,0169 |
=99,76%
Результаты определения точности методики показали, что теоретические и экспериментальные значения количественного содержания сесквитерпеновых лактонов в траве соссюреи практически полностью совпадают. Величина относительного стандартного отклонения (RSD) не превышает 5%, а открываемость R составляет 99,76%, что характеризует точность методики как удовлетворительную.
Установлено, что предлагаемая методика количественного определения сесквитерпеновых лактонов методом ВЭЖХ в траве соссюреи горькой является специфичной, воспроизводимой и точной, что предполагает рекомендовать данную методику при контроле качества лекарственного растительного сырья «Соссюреи горькой трава».
Рецензенты:
Гришин А.В. д. фарм. н., профессор, зав. кафедрой фармации ГБОУ ВПО ОмГМА Минздрава России, г. Омск.
Пеньевская Н.А. д. мед. н., доцент, зав. кафедрой фармацевтической технологии с курсом биотехнологии ГБОУ ВПО «ОмГМА» Минздрава России, г. Омск.