Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

АКТИВНОСТЬ НЕКОТОРЫХ ФЕРМЕНТОВ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ПОВРЕЖДЕНИЯ ПОЧКИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Серебряков А.А. 1 Мусатов О.В. 1 Луцева О.А. 1 Коханов А.В. 1 Зурнаджан С.А. 1
1 ФГБОУ ВО «Астраханский государственный медицинский университет» Минздрава России
С целью поиска и отбора специфического биохимического маркера острого повреждения почечной ткани в экспериментах на кроликах исследована активность ряда ферментов. После моделирования хирургическим путем дозированной травмы в виде рвано-ушибленной раны почки и печени или повреждения этих паренхиматозных органов нефро- и гепатотоксическим агентом в крови животных определяли активность лизоцима (ЛЗЦ), аланин- (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), щелочной фосфатазы (ЩФ), γ-глютамилтранспептидазы (ГГТП) и нейтральной α-глюкозидазы (НАГ) в динамике на 1, 3, 5, 7, 14 и 21-е сутки эксперимента. Показателем острого паренхиматозного повреждения печени являлся количественный тест на сывороточный альфа-фетопротеин (АФП). Установлено, что после механического повреждения печени и почки начиная с 1 дня с различной интенсивностью и динамикой в крови повышается активность всех исследованных ферментов. Ингаляция CCl4 вызывала острое повреждение печени, но не почки, сопровождавшееся подъемом АФП, ЛДГ и ГГТП. Внутримышечное введение глицерина не вызывало токсического повреждения печени и существенного увеличения АФП, но приводило к развитию острой почечной недостаточности, подтвержденной гистологически. Индикаторным ферментом для нефропатии можно считать только НАГ, активность которого в сыворотке крови при повреждении почки травматического и токсического генеза выше, чем при обоих типах повреждения печени. Результаты могут иметь значение для дифференциальной диагностики патологии почек с латентным течением.
эксперименты на кроликах
моделирование раны почки и печени
токсическое повреждение почки и печени
активность индикаторных ферментов в крови кроликов
дифференциально-диагностическое значение
1. Charlton R.J. A basic science view of acute kidney injury biomarkers / R.J. Charlton, D. Portilla, M.D. Okusa // Nephrology Dialysis Transplantation. − 2014. − Vol. 29, N 7. − P. 1301–1311.
2. Gaut J.P. Development of an immunoassay for the kidney-specific protein myo-inositol oxygenase, a potential biomarker of acute kidney injury / J.P. Gaut [et al.] // Clin. Chem. − 2014. − Vol. 60, N 5. − P. 708-710.
3. Щетинин К.В. Показатели мочевой экскреции ферментов почечного происхождения у больных мочекаменной болезнью после хирургического удаления конкрементов / К.В. Щетинин [и др.]. // Современные проблемы науки и образования. – 2016. – № 2. - URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=24417 (дата обращения: 23.04.2018).
4. Murray P.T. Potential use of biomarkers in acute kidney injury: report and summary of recommendations from the 10th Acute Dialysis Quality Initiative consensus conference / P.Т. Murray [et al.] // Kidney International. − 2014. − Vol. 85. − P. 513–521.
5. Nejat M. Rapid detection of acute kidney injury by plasma cystatin C in the intensive care unit / M. Nejat, J.W. Pickering, R.J. Walker, Z.H. Endre // Nephrol. Dial. Transplant. – 2010. – Vol. 25. – Р. 3283–3289.
6. Клиническое значение определения липокалина, ассоциированного с желатиназой, при хронической болезни почек / В.Б. Бородулин [и др.]. // Вестник Волгоградского гос. мед. университета. − 2014. − № 3. − С. 123-126.
7. Фергюсон М.А. Установленные и вновь предлагаемые маркеры функции почек / М.А. Фергюсон, С.С. Вайкар // Клиническая лабораторная диагностика. – 2013. – № 11. – С. 3–11.
8. Мусатов О.В. Динамика индикаторных ферментов сыворотки крови в зависимости от видов операций при разрыве почки в эксперименте / О.В. Мусатов, С.А. Зурнаджан, А.В. Коханов // Экспериментальная и клиническая урология. − 2014. − № 1. − С. 16-19.
9. Климович И.Н. Пути улучшения диагностики и лечения гепаторенального синдрома у больных острой абдоминальной хирургической патологией: автореф. дис. … д-ра мед. наук. − Волгоград, 2007. − 45 с.
10. Мусатов О.В. Активность щелочной фосфатазы сыворотки крови в зависимости от вида операции при ранах печени, селезенки и почки в эксперименте / О.В. Мусатов, С.А. Зурнаджан, А.В. Коханов // Астраханский медицинский журнал. − 2017. − Т. 12, № 2. − С. 63-69.
11. Классификация гепаторенального синдрома у больных острой абдоминальной хирургической патологией / Г.И. Жидовинов [и др.]. // Вестник Волгоградского гос. мед. университета. − 2007. − № 2. − С. 43-47.
12. Коняева А.Г. О влиянии глюкокортикоидов на синтез α-фетопротеина и структуру печени мышей при остром отравлении четыреххлористым углеродом / А.Г. Коняева, Ф.Э. Вишневецкий // Бюллетень эксперим. биол. и мед. – 1977. – № 2. – С. 151-153.
13. Джиоев И.Г. Некоторые особенности функции и морфологии почек крыс в условиях различных моделей экспериментальной почечной недостаточности / И.Г. Джиоев, А.М. Фидарова // Вестник новых медицинских технологий. – 2008. – Т. XV. – № 1. – С. 38-39.
14. Мусатов О.В. Сравнительная оценка динамики сывороточного лизоцима после гастропластики ран печени, селезенки и почки в эксперименте // Хирург. – 2011. – № 1. – С. 8-12.
15. Диагностическое значение определения активности нейтральной α-глюкозидазы и N-ацетил-β-D-гексозаминидазы в моче при патологии почек / И.С. Лукомская [и др.] // Вопросы мед. химии. – 1986. – Т. 32, № 5. – С. 112-119.

В последние десятилетия в придачу к «золотым стандартам» лабораторной диагностики нефропатий, таких как скорость клубочковой фильтрации (СКФ), микроальбуминурия, креатинин и мочевина, прибавился целый список индикаторов патологии почек, прежде всего за счет открытия уникальных биохимических маркеров повреждения почек [1-3], предназначенных для диагностики, мониторинга и оценки качества лечения острой и хронической нефропатии различного генеза. Эти биомаркеры, несущие специфическую информацию о функции почек на различных уровнях (клубочковая фильтрация, канальцевая реабсорбция), представляют собой низкомолекулярные белки или пептиды, фильтрующиеся в мочу, где они и определяются с помощью современных высокочувствительных методов иммунохимического анализа [3-5]. То есть при заболеваниях почек и мочевыводящих путей биохимический анализ мочи является более информативным, чем анализ крови [4; 6; 7].

Однако в экспериментах на животных для диагностики ранних нарушений функции почек кровь является более удобным объектом исследования, чем моча [8]. При этом после острого и хронического эксперимента в крови у лабораторных животных предпочтительней оценивать активность индикаторных ферментов, чем уровень видо- и органоспецифических почечных маркеров, определяемых иммунохимическими методами [8].

Среди ферментов мочи, имеющих только почечное происхождение, представляет интерес нейтральная α-глюкозидаза (НАГ), связанная со специфическими метаболическими процессами в петле Генле и в клетках эпителия проксимальных канальцев и отсутствующая в других морфологических образованиях почки (например, в клубочках) [3]. Однако из-за низкой активности этого фермента в сыворотке крови вопрос о связи сывороточной НАГ с дисфункцией почек в научной литературе не освещен.

Кроме того, любое повреждение паренхиматозного органа, в том числе и почки, влечет за собой системную воспалительную реакцию и острофазовый ответ, сопряженные с метаболическим взрывом в печени и развитием неспецифической гиперферментемии [8-10]. Еще более неопределенная ситуация с интерпретацией гиперферментемии возникает в случае взаимно отягощающего гепаторенального синдрома [9; 11].

Цель исследования – сравнить активность ряда ферментов в сыворотках крови кроликов после моделирования у них травматического или токсического повреждения почки и печени и отобрать среди них ферменты, наиболее характерные для острого повреждения почечной ткани.

Материалы и методы исследования. Эксперименты выполнены на 54 кроликах породы шиншилла в возрасте 0,5-1,5 лет и массой 1,5-2,0 кг в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием лабораторных животных» [8]. Животные были распределены на 2 опытные группы, подвергавшиеся оперативному воздействию, и 2 группы, на которых моделировали острые токсические повреждения (ОТП) печени и почки.

В первых двух группах кроликов по 17 животных в каждой под эфирным наркозом через лапаротомический разрез с помощью разработанного авторами устройства по передней поверхности печени (I группа) или наружному краю левой почки (II группа) разрывалась паренхима с моделированием идентичных рвано-ушибленных ран размером 0,6×0,2 см и глубиной 0,2 см, не проникающая в систему полостей. Раны печени и почки ушивали двойным восьмиобразным гемостатическим швом [8; 10].

10 кроликов III группы поочередно подвергали воздействию четыреххлористым углеродом (CCl4) в закрытом аквариуме емкостью 20 л, на дно которого наносили 0,5 мл CCl4 (время экспозиции 15 минут). Показателем степени острого токсического повреждения (ОТП) печени являлся иммунохимический тест на сывороточный альфа-фетопротеин (АФП) [12]. В IV группе кроликов (10 животных) моделировали ОТП почки (токсический нефрит) путем внутримышечного введения 50% раствора глицерина из расчета 0,8 мл/100 г веса. Внутримышечное введение глицерина приводит к развитию рабдомиолиза и выбросу в кровь большого количества свободного миоглобина. Миоглобин вызывает острое токсическое повреждение различных систем и органов, но в большей степени – почек, где развивается токсическое поражение клубочкового и канальцевого аппарата почек [13].

У кроликов всех групп до и на сроках 1, 3, 5, 7, 14 суток после операций и моделирования токсического повреждения из ушной вены производился забор крови в объеме 2,5 мл. Сыворотки крови, разлитые по аликвотам 0,5 мл, хранились до исследования при -20 °С без консерванта.

Активность лизоцима (ЛЗЦ) в сыворотках крови кроликов определяли колориметрическим микрометодом [14] путем измерения оптической плотности в образцах с тест-культурой микрококка. Концентрацию АФП в сыворотках крови кроликов определяли методом ИФА [2]. Активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), гамма-глютамилтранспептидазы (ГГТП) и щелочной фосфатазы (ЩФ) измеряли на биохимическом анализаторе Microlab с набором реагентов (Vitalab, Нидерланды) [8]. Активность нейтральной α-глюкозидазы (НАГ) в образцах забуференной (рН 6,5) кроличьей сыворотки оценивали модифицированным косвенным методом И.С. Лукомской и соавт. [15] по нарастанию концентрации глюкозы (Δ ммоль/л) в присутствии добавленного до конечной концентрации 1% субстрата мальтозы.

Результаты обработаны методами описательной статистики с помощью прикладных пакетов программ Statistica, Ехсel и после проверки распределения выборок на нормальность представлены в виде средних значений и их ошибок (М+m). Достоверность различий между группами оценивали по U-критерию Манна–Уитни. Достоверными считали различия при рU < 0,05 [10].

Результаты исследований и их обсуждение. В сыворотках крови 54 кроликов до экспериментов (контроль) средние значения активностей семи исследованных ферментов составили 11,6±0,75 МЕ/л - для АЛТ, 10,0±0,82 МЕ/л - для АСТ, 193±11,7 МЕ/л - для ЛДГ, 52,5±3,59 МЕ/л - для ЩФ, 3,9±0,31 МЕ/л - для ГГТП, 1,6±0,10 МЕ/л - для ЛЗЦ и 3,2±0,22 ммоль/л глюкозы - для НАГ. Средняя концентрация АФП в крови интактных кроликов составила 6,1±0,71 нг/мл. Результаты определения активности ферментов и уровней АФП в различные сроки в 4 группах эксперимента представлены в таблице и на рис. 1-3 (в виде отношения средних величин в экспериментальных группах к значениям контроля).

После механического и токсического повреждения печени и почки в крови кроликов во все сроки наблюдения с различной интенсивностью и динамикой достоверно (p<0,05) по сравнению с контролем повышается активность АЛТ, АСТ, ЛДГ, ЩФ и ГГТП (таблица).

Динамика изменения активности ферментов и уровня АФП в крови у кроликов после моделирования травматического и токсического повреждения печени и почки

Показатели

Сутки

Активность фермента в МЕ/л (M±m)

   

Контроль

(до экспери-мента)

n=54

I группа

(Травма

печени)

n=17

II группа

(Травма

почки)

n=17

III группа

(ОТП

печени)

n=10

IV группа

(ОТП

почки)

n=10

АЛТ

1-е

11,6±0,75

46,0±2,93*^

70,2±4,09*^^

58,3±2,92^

51,4±3,96^^

3-и

 

48,4±2,29*^

71,1±4,07*

78,6±5,25^

67,3±5,94

5-е

 

38,1±1,46*^

64,8±2,77*^^

77,4±4,89^

80,4±5,08^^

7-е

 

44,8±2,94*^

60,2±3,23*^^

75,8±4,97^

69,6±4,65^^

14-е

 

46,6±3,01^

50,1±3,08^^

66,2±3,74^

62,0±3,99^^

21-е

 

41,4±2,14^

44,7±2,04^^

53,6±3,40^

53,6±3,51^^

АСТ

1-е

10,0±0,82

40,4±2,74*^

62,0±3,72*^^

70,6±5,49**^

26,9±3,62**^^

3-и

 

42,2±2,94*^

64,2±3,33*^^

62,9±5,02^

53,2±5,93^^

5-е

 

39,4±2,36*^

62,8±3,28*

66,4±4,89^

69,0±5,28

7-е

 

30,3±2,91*^

58,4±3,09*^^

54,7±4,70**^

72,9±5,74**^^

14-е

 

24,7±1,95*^

40,1±2,93*^^

37,6±3,49**^

56,4±5,15**^^

21-е

 

19,7±1,71*^

25,2±2,02*^^

29,7±3,40**^

48,7±4,26**^^

ЛДГ

1-е

193±11,7

806±60,6*^

427±34,6*

500±43,7**^

402±37,2**

3-и

 

847±65,6*

448±35,8*^^

749±60,9**

534±47,3**^^

5-е

 

886±67,6*^

371±26,7*^^

1280±121,1**^

612±56,4**^^

7-е

 

912±73,7*

375±30,7*^^

1036,6±86,2**

591±59,2**^^

14-е

 

748±59,5*

297±29,0*^^

912±91,1**

485±41,6**^^

21-е

 

466±45,6*

262±26,3*^^

469,2±43,84

374±33,5^^

ЩФ

1-е

52,5±3,59

248,6±30,50*^

184,5±22,99*^^

318,7±35,59^

337,4±40,24^^

3-и

 

241,3±17,68

222,1±19,95

242,8±28,62

279,2±39,88

5-е

 

227,5±11,64

203,5±17,44

214,7±28,44

256,7±31,22

7-е

 

258,9±21,31*

183,6±13,42*

290,6±36,68

223,0±29,51

14-е

 

240,7±18,87*

132,4±12,67*^^

231,2±31,26

194,1±21,55^^

21-е

 

125,5±11,48^

112,5±8,76^^

257,9±28,64**^

143,3±14,46**^^

ГГТП

1-е

3,9±0,31

11,9±0,86*

7,7±0,67*

11,0±1,11**

6,5±0,85**

3-и

 

13,7±0,91*

9,5±0,86*

14,9±1,45**

8,2±0,95**

5-е

 

14,7±1,08*

10,3±0,95*

13,7±1,38**

11,0±0,98**

7-е

 

12,4±0,94*

9,7±0,78*

10,0±1,24

10,9±1,03

14-е

 

10,0±0,80*

8,1±0,58*^^

8,5±0,96

10,3±1,01^^

21-е

 

7,8±0,81*

6,2±0,54*^^

6,6±0,92

8,3±0,90^^

ЛЗЦ

1-е

1,6±0,10

1,8±0,22

2,1±0,26

1,9±0,39

2,5±0,36

3-и

 

2,4±0,25^

2,5±0,36

1,8±0,34**^

3,2±0,54**

5-е

 

2,9±0,33

2,9±0,41

2,2±0,49**

4,0±0,62**

7-е

 

3,2±0,36

3,2±0,39

2,7±0,53

4,1±0,58

14-е

 

2,7±0,32

2,8±0,29^^

3,3±0,45

4,3±0,51^^

21-е

 

2,3±0,27

2,3±0,26^^

1,8±0,34**

3,8±0,45**^^

НАГ (ммоль/л

глюкозы)

1-е

3,2±0,22

3,8±0,62*

6,1±0,77*

3,9±0,72**

6,5±0,82**

3-и

 

5,4±0,73*

9,5±0,84*

4,8±0,70**

10,2±1,53**

5-е

 

6,3±0,89*

10,9±0,92*

5,2±0,87**

11,0±1,48**

7-е

 

5,2±0,80*

8,2±0,75*^^

4,7±0,76**

11,1±1,22**^^

14-е

 

4,7±0,76

5,8±0,69^^

4,3±0,73**

10,3±1,08**^^

21-е

 

4,3±0,68

4,3±0,56^^

3,8±0,71**

6,8±0,66**^^

АФП

нг/мл

1-е

6,1±0,71

10,7±1,90

9,1±1,93

18,8±5,60**

6,7±1,35**

3-и

 

35,3±8,31

17,5±3,72

48,7±11,34**

9,4±2,86**

5-е

 

36,2±9,81*

12,8±2,49*

32,1±7,78**

10,0±2,92**

7-е

 

23,1±4,53

13,3±2,09

27,6±6,91**

10,3±3,13**

14-е

 

18,0±3,68*

9,8±1,92*

13,3±3,59

6,8±1,31

21-е

 

10,5±2,26*

5,3±0,97*

11,8±1,80

7,3±1,25

Примечание:

достоверные различия (p<0,05) по сравнению с контролем – выделены серой заливкой ячейки таблицы.

* – достоверные различия (p<0,05) между группами I «Травма печени» и II «Травма почки».

** – достоверные различия (p<0,05) между группами III «ОТП печени» и IV «ОТП почки».

^ – достоверные различия (p<0,05) между группами I «Травма печени» и III «ОТП печени».

^^ – достоверные различия (p<0,05) между группами II «Травма почки» и IV «ОТП почки».

При этом активность АЛТ, АСТ, ЛДГ и ЩФ во всех экспериментальных группах увеличивалась на 500-700% (таблица, рис. 1). Существенно не отличались от контрольных значений только уровни ЛЗЦ и НАГ в 1-е сутки после механической травмы печени, НАГ в группе «ОТП печени» и АФП в группе «травма почки» в 1-е и последние сутки эксперимента, АФП во все сроки после ОТП почки и ЛЗЦ после ОТП печени на 1, 3, 5-е сутки и в конце эксперимента (таблица).

а б

в г

Рис. 1. Динамика изменения активности АСТ, АЛТ, ЛДГ и ЩФ в крови у кроликов после моделирования травматического и токсического повреждения печени и почки в % к контрольным цифрам (а – АСТ; б – АЛТ; в – ЛДГ; г – ЩФ)

Средние величины АЛТ, АСТ, НАГ были выше и при экспериментальных травмах, и при ОТП почки, а ЛДГ, ЩФ, ГГТП и АФП – выше при травмах и ОТП печени. Межорганные различия по ЛДГ и НАГ наблюдались как в случае механической травмы, так и ОТП печени и почки, а по АЛТ достоверно отличались только после механической травмы, но не после токсического поражения печени и почки.

д е

Рис. 2. Динамика изменения активности ГГТП и концентрации АФП в крови у кроликов после моделирования травматического и токсического повреждения печени и почки в % к контрольным цифрам (д – АФП; е – ГГТП)

Достоверные межорганные различия по АСТ, ГГТП и ЛЗЦ после ОТП наблюдались без определенной закономерности. Не установлено статистически достоверных межорганных различий по активности ЩФ после ОТП печени и почки, а по ЛЗЦ – после механических травм этих паренхиматозных органов (таблица).

ж з

Рис. 3. Динамика изменения активности НАГ и лизоцима в крови у кроликов после моделирования травматического и токсического повреждения печени и почки в % к контрольным цифрам (ж – лизоцим; з – НАГ)

Инъекции глицерина кроликам гистологически проявлялись начиная с 3 суток и во все последующие сроки наблюдения нарастающими признаками острой почечной недостаточности у животных (отеком клубочков и канальцев, их сужением и закрытием, плазматической имбибицией стенок сосудов и их облитерацией), а биохимически – стойким сохранением повышенных уровней АЛТ, АСТ, ГГТП, ЛЗЦ и НАГ во все сроки наблюдения (рис. 1-3). Наоборот, ингаляционное ОТП печени четыреххлористым углеродом (CCl4) продолжалось на протяжении только одной недели, о чем свидетельствовала нормализация после 7-х суток уровней АФП и большинства ферментов (рис. 2).

При сравнении механической и токсической моделей поражения почки и печени (таблица) выявлено, что ОТП печени и почек приводит к достоверно большей активации ферментов АЛТ и АСТ, чем механическая травма обоих органов, а ЛДГ достоверно не дифференцирует характер повреждения печени, но различает модель повреждения почки. Повреждение печени, но не почки сопровождается повышением АФП, ЛДГ и ГГТП (таблица, рис. 1-3). Из исследованных ферментов только НАГ в максимальной степени отражает повреждение почки, но не печени вне зависимости от этиологии повреждения (рис. 3).

Выводы

Установлено, что индикаторным ферментом при повреждении почки травматического и токсического генеза можно считать только НАГ. Введение глицерина не вызывает существенного увеличения НАГ, но не АФП, что свидетельствует о специфическом нефротоксическом действии данного агента. Полученные результаты могут иметь значение для дифференциальной диагностики патологии почек с латентным течением.


Библиографическая ссылка

Серебряков А.А., Мусатов О.В., Луцева О.А., Коханов А.В., Зурнаджан С.А. АКТИВНОСТЬ НЕКОТОРЫХ ФЕРМЕНТОВ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ПОВРЕЖДЕНИЯ ПОЧКИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ // Современные проблемы науки и образования. – 2018. – № 3. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=27717 (дата обращения: 13.08.2022).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074