Ввиду повсеместного применения наносеребро может рассматриваться как потенциальный загрязнитель окружающей среды [17, 31, 33]. Токсикологические свойства наносеребра весьма неоднозначны и значительно отличаются от таковых, в сравнении с солями серебра [20, 21, 25, 32]. Традиционно авторы изучают влияние на живые организмы высоких доз наносеребра, в основном при парентеральном или ингаляционном пути их введении [5, 20, 24, 25]. При этом недостаточно исследованы биоэффекты серебра при хроническом пероральном поступлении его в низких дозах, между тем именно такая ситуация становится наиболее вероятной при загрязнении им окружающей среды [5, 33].
Цель работы – изучить влияние хронического перорального употребления раствора наночастиц серебра с концентрацией 5 мг/л на выраженность процессов свободно-радикального окисления в организме крыс.
Материалы и методы исследования
Исследования на животных выполнены в лаборатории кафедры общей и клинической патологической физиологии ФГБОУ ВО КубГМУ МЗ РФ, а дальнейшее изучение полученного биоматериала проводилось на базе ФГБОУ ВО КубГУ. Эксперименты проведены на 24 белых нелинейных крысах-самцах средней массой 98±1,5 грамм. Эксперимент на животных продолжался с 20 октября по 18 ноября 2015 года. Крысы содержались в условиях 12 часового светового дня, постоянной комнатной температуры 25 0С, свободного доступа к воде и корму. Содержание животных и постановка экспериментов проводились в соответствии с международными правилами «Guide for the Careand Use of Laboratory Animals».
Наноразмерное серебро синтезировано методом кавитационно-диффузионного фотохимического восстановления на базе ФГБОУ ВПО КубГУ [1, 2]. Исследуемый раствор наносеребра ежедневно получали путем разведения препарата в питьевой воде до рабочей концентрации 5мг/л.
Характеристика групп животных: группа № 1 (n=12) – контрольная, крысы получали в течение 30 суток питьевую воду; группа № 2 (n=12) – опытная, крысы получали на протяжении 30 дней питьевую воду с концентрацией наночастиц серебра 5мг/л. Разбивка крыс на группы проводилась случайным образом.
В ходе эксперимента ежедневно рассчитывалось количество серебра, поступившего в организм крысы за сутки из расчета на 1 килограмм массы тела (Дсут – суточная доза), с последующим определением его суммарного потребления за 30 дней из расчета на 1 килограмм массы тела (Дк – курсовая доза). Взвешивание крыс в ходе эксперимента проводилось ежедневно.
Спустя 30 дней (завершение эксперимента), крысы обеих групп подвергались эвтаназия путем декапитации, предварительно животные вводились в золетил-ксилазиновый наркоз [7]. У трупа проводился забор головного мозга, печени, почек, сердца, селезенки и тонкого кишечника.
Для визуализации и описания наночастиц серебра использован растровый электронный микроскоп JEOLJSM-7500F.
Содержание серебра во внутренних органах определяли методом масс-спектрометрии с использованием квадрупольного масс-спектрометра с индуктивно связанной плазмой ThermoScientific – Xseries II (США), пробоподготовка проводилась по Rooney [29].
Оценку содержания свободных радикалов в органах проводили путем измерения спектров ЭПР на спектрометре JES FA300 (JEOL, Япония) в Х-диaпазоне. Условия измерения: СВЧ мощность 1 мBт, частота микроволнового излучения 9144 МГц, амплитуда высокочастотной модуляции 0,1 мТл. Образцы измеряли в кварцевой ампуле (5 мм), масса навески в зоне резонатора составляла 0,03 г.
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программного обеспечения «Statistica 10 version» фирмы «StatSoftInc.». Данные взвешивания крыс и измерения размеров наночастиц серебра выражали путем расчета среднего (M) и стандартного отклонения (SD), в виде M±SD. Полученные результаты исследуемых групп после статистической обработки выражали в виде медианы (Me) с использованием 25 и 75 процентилей (p25 и p75). Для проверки гипотезы о гауссовом распределении показателей в исследуемых группах использовали критерий Шапиро – Уилка. В связи с тем, что распределение значений исследуемых показателей в группах отличалось от нормального, их сравнение проводилось по непараметрическому критерию Манна – Уитни (Utest), с установлением уровня значимости *p≤0,01.
Результаты и их обсуждение
В течение всего периода работы случаев выведения животных из исследования не было. При осмотре внешний вид и поведение крыс в группах № 1 и № 2 видимых отличий не имели. На момент окончания эксперимента средняя масса крыс в группе № 1 составила 148±8 грамм, а в группе № 2 – 150±6 грамм, при этом статистически значимых отличий между группами не выявлено (p≥0,01).
По данным электронной микроскопии наночастицы серебра имели сферическую форму и средний размер 12,5 ± 2,5 нм. В нашей работе мы сосредоточились на исследовании биологических свойств низких концентраций наносеребра при его хроническом пероральном поступлении в организм крыс, в условиях именно свободного спаивания его раствора (ситуация, по нашему мнению, наиболее приближенная к реальной). Дк за период исследования (30 дней) составила 8,2±0,96 мг/кг, что на порядок ниже в сравнении с работами аналогичного профиля [3-5, 8, 16, 23, 32].
Данные масс-спектрометрии показывают, 30-дневное употребление питьевой воды с концентрацией наночастиц серебра 5 мг/л приводит к статистически значимому (p=0,0001≤0,01), в сравнении с контролем, увеличению содержания серебра во внутренних органах крыс из группы № 2. Содержание серебра возрастает в почках в 94 раза, головном мозге в 58 раз, тонком кишечнике в 32,5 раз, селезенке – 21,8 раз, печени – 15,6 раз, сердце в 4,4 раза крыс, что отражает выраженные кумулятивные свойства наночастиц серебра (табл. 1).
Таблица 1
Содержание серебра во внутренних органах крыс из групп № 1 и № 2
Ткань мкг/г |
Почки |
Головной мозг |
Тонкий кишечник |
Селезенка |
Печень |
Сердце |
|
Группа №1 |
Me |
0,010 |
0,004 |
0,006 |
0,005 |
0,006 |
0,014 |
p75 |
0,011 |
0,006 |
0,002 |
0,004 |
0,007 |
0,019 |
|
p25 |
0,005 |
0,003 |
0,008 |
0,007 |
0,005 |
0,012 |
|
U test |
p≤0,01 |
0,0001 |
0,0001 |
0,0001 |
0,0001 |
0,0001 |
0,0001 |
Группа №2 |
Me |
0,940 |
0,232 |
0,195 |
0,109 |
0,094 |
0,062 |
p75 |
0,931 |
0,250 |
0,189 |
0,098 |
0,098 |
0,069 |
|
p25 |
0,948 |
0,210 |
0,199 |
0,122 |
0,084 |
0,061 |
ЭПР-спектроскопия показывает, содержание свободных радикалов в головном мозге (на 22,6 %), печени (на 29,5 %) и сердце (на 88,1 %) снижается (p=0,0001≤0,01), в тонком кишечнике достоверно не меняется (p=0,0140≥0,01), а в селезенке (на 92,3 %) и почках (на 51,3 %) значительно возрастает (p=0,0001≤0,01) (табл.2).
К моменту окончания эксперимента содержание серебра в ткани мозга возрастает в 58 раз, но в то же время, по данным ЭПР-спектроскопии, содержание свободных радикалов в нем снижается практически на 22,6 %. Основываясь на полученных данных, можно сделать предположение о наличии антиоксидантных свойствах наносеребра. О значительных кумулятивных свойствах наноразмерного серебра в отношении ткани головного мозга было известно и ранее [11]. Однако в большинстве известных литературных источников описывается выраженный прооксидантный эффект наноразмерного серебра. Индукции реакций свободно-радикального окисления, а также активации апоптоза отводится ключевая роль в его нейротоксическом влиянии [6, 17].
Анализируя данные литературы, мы видим, что выводы о нейротоксичности серебра основываются преимущественно на результатах культуральных исследований [19, 32]. В частности показана дозозависимая способность наносеребра, вызывать нарушения в работе ферментов цепи переноса электронов [14]. В то же время известно, что митохондриальную дисфункцию вызывают лишь частицы серебра размером 75 нм, а более мелкие размером 10 нм напротив, запускают нейрональные стресс-протективные пути [13]. Показана способность наносеребра с размером частиц 70 нм к выраженной кумуляции в организме, а также их дозозависимые негативные эффекты на культурах клеток крыс и человека, выявлена значительная модификация негативных свойств серебра при взаимодействии с белками при in vivo применении [9].
Таблица 2
Концентрация парамагнитных центров во внутренних органах исследуемых крыс
Ткань |
Печень |
Головной мозг |
Тонкий кишечник |
Селезенка |
Сердце |
Почки |
|
Группа№1 |
Me |
10849 |
2654 |
2278 |
975 |
833 |
264 |
p75 |
10911 |
2783 |
2295 |
1014 |
902 |
289 |
|
p25 |
10544 |
2578 |
2199 |
922 |
789 |
247 |
|
U test |
p≤0,01 |
0,0001 |
0,0001 |
0,0140* |
0,0001 |
0,0001 |
0,0001 |
Группа №2 |
Me |
7648 |
2053 |
2006 |
12734 |
99 |
539 |
p75 |
7699 |
2156 |
2186 |
13842 |
109 |
622 |
|
p25 |
7523 |
2038 |
1927 |
12114 |
94 |
515 |
Несмотря на то, что серебро из организма в основном выводится с калом, наибольшее его накопление отмечено для почек (рост в 94 раза), при этом содержание свободных радикалов в них также возросло на 51,3 %. Много серебра накапливалось в селезенке (рост в 21,8 раз), при этом содержание свободных радикалов в ней возросло на 92,3 %. Полученные результаты хорошо согласуются с описанными в литературных источниках [20, 28].
В настоящее время не существует единого мнения по вопросу влияния наносеребра на печень. Многие авторы показывают его токсичность, которая проявляется в виде активации процессов свободно-радикального окисления, некроза и апоптоза гепатоцитов, воспалительных изменений в паренхиме печени, а также увеличения содержания маркеров цитолиза в крови [10, 15-18, 23, 28]. Однако существуют исследования, отрицающие токсическое действие даже высоких доз наносеребра [20, 22, 27].
В нашей же работе содержание серебра в печени возрастает в 15,6 раз, что значительно уступает его содержанию в почках, головном мозге, тонком кишечнике и селезенке (табл.1), эту особенность можно объяснить высокой активностью процессов выведения серебра из печени [11, 20]. Содержание свободных радикалов в печени на этом фоне падает на 29,5 % (табл.2). Так как основным поставщиком радикалов в печени является микросомальная система окисления, то можно было бы предположить факт снижения их содержания ее угнетением, однако существуют исследования, отрицающие данную возможность [26]. В то же время имеются работы, показывающие, что наносеребро не только запускает реакции свободно-радикального окисления, но и выступает в качестве стимулятора экспрессии антиоксидантных ферментов [12].
В литературе известно явление выраженного нарушение функции эпителия тонкого кишечника у крыс при употреблении растворов наносеребра вследствие разрушения микроворсинок [30]. В нашей работе, несмотря на увеличение содержания серебра в кишечнике в 32,5 раз, мы наблюдали некоторое снижение содержания свободных радикалов, которое, однако, статистически достоверным не являлось.
К окончанию исследования содержание серебра в сердце крыс возрастало в 4,4 раза, а количество свободных радикалов, напротив, снижалось на 88,1 %, что показывает выраженные антиоксидантные свойства исследуемого раствора наносеребра, что в целом не соответствует данным литературы [16].
В зависимости от свойств наночастиц серебра, их дозировки, пути и способа применения меняется их проникающая и кумулятивная способность, а также динамика продукции ими ионов серебра, ответственных за его токсические эффекты. Этим объясняется наличие полярных воззрений на сущность биоэффектов, возникающих в организме животных и человека при хроническом пероральном употреблении растворов наносеребра [17, 22, 27, 28].
Заключение
30-дневное употребление крысами питьевой воды с концентрацией наносеребра 5 мг/л приводит к увеличению его содержания в почках в 94 раза, головном мозге в 58 раз, тонком кишечнике в 32,5 раз, селезенке 21,8 раз, печени 15,6 раз и сердце в 4,4 раз. По данным ЭПР-спектроскопии, мы видим, что содержание свободных радикалов в головном мозге на 22,6 %, печени на 29,5 % и сердце на 88,1 % ниже, в тонком кишечнике достоверных изменений не выявлено, а в селезенке на 92,3% и почках на 51,3% оно возрастает.
Таким образом, употребление крысами раствора с концентрацией наносеребра 5 мг/литр и средним размером частиц 12,5 ± 2,5 нм в течение 30 дней характеризуется значительным его накоплением во внутренних органах и разнонаправленными по выраженности изменениями активности процессов свободно-радикального окисления.
Библиографическая ссылка
Власов Р.В., Каде А.Х., Барышев М.Г., Трофименко А.И., Шашков Д.И., Туровая А.Ю., Романовский К.А., Башинский А.Е., Гончарова Е.Н., Уварова Е.А., Пишкина А.Ю., Черкесова Д.Р. ВЛИЯНИЕ ХРОНИЧЕСКОГО ПЕРОРАЛЬНОГО ПОСТУПЛЕНИЯ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА НА АКТИВНОСТЬ ПРОЦЕССОВ СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ У КРЫС // Современные проблемы науки и образования. – 2017. – № 2. ;URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=26190 (дата обращения: 08.12.2024).