Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Ввиду повсеместного применения наносеребро может рассматриваться как потенциальный загрязнитель окружающей среды [17, 31, 33]. Токсикологические свойства наносеребра весьма неоднозначны и значительно отличаются от таковых, в сравнении с солями серебра [20, 21, 25, 32]. Традиционно авторы изучают влияние на живые организмы высоких доз наносеребра, в основном при парентеральном или ингаляционном пути их введении [5, 20, 24, 25]. При этом недостаточно исследованы биоэффекты серебра при хроническом пероральном поступлении его в низких дозах, между тем именно такая ситуация становится наиболее вероятной при загрязнении им окружающей среды [5, 33].

Цель работы – изучить влияние хронического перорального употребления раствора наночастиц серебра с концентрацией 5 мг/л на выраженность процессов свободно-радикального окисления в организме крыс.

Материалы и методы исследования

Исследования на животных выполнены в лаборатории кафедры общей и клинической патологической физиологии ФГБОУ ВО КубГМУ МЗ РФ, а дальнейшее изучение полученного биоматериала проводилось на базе ФГБОУ ВО КубГУ. Эксперименты проведены на 24 белых нелинейных крысах-самцах средней массой 98±1,5 грамм. Эксперимент на животных продолжался с 20 октября по 18 ноября 2015 года. Крысы содержались в условиях 12 часового светового дня, постоянной комнатной температуры 25 ⁰С, свободного доступа к воде и корму. Содержание животных и постановка экспериментов проводились в соответствии с международными правилами «Guide for the Careand Use of Laboratory Animals».

Наноразмерное серебро синтезировано методом кавитационно-диффузионного фотохимического восстановления на базе ФГБОУ ВПО КубГУ [1, 2]. Исследуемый раствор наносеребра ежедневно получали путем разведения препарата в питьевой воде до рабочей концентрации 5мг/л.

Характеристика групп животных: группа № 1 (n=12) – контрольная, крысы получали в течение 30 суток питьевую воду; группа № 2 (n=12) – опытная, крысы получали на протяжении 30 дней питьевую воду с концентрацией наночастиц серебра 5мг/л. Разбивка крыс на группы проводилась случайным образом.

В ходе эксперимента ежедневно рассчитывалось количество серебра, поступившего в организм крысы за сутки из расчета на 1 килограмм массы тела (Дсут – суточная доза), с последующим определением его суммарного потребления за 30 дней из расчета на 1 килограмм массы тела (Дк – курсовая доза). Взвешивание крыс в ходе эксперимента проводилось ежедневно.

Спустя 30 дней (завершение эксперимента), крысы обеих групп подвергались эвтаназия путем декапитации, предварительно животные вводились в золетил-ксилазиновый наркоз [7]. У трупа проводился забор головного мозга, печени, почек, сердца, селезенки и тонкого кишечника.

Для визуализации и описания наночастиц серебра использован растровый электронный микроскоп JEOLJSM-7500F.

Содержание серебра во внутренних органах определяли методом масс-спектрометрии с использованием квадрупольного масс-спектрометра с индуктивно связанной плазмой ThermoScientific – Xseries II (США), пробоподготовка проводилась по Rooney [29].

Оценку содержания свободных радикалов в органах проводили путем измерения спектров ЭПР на спектрометре JES FA300 (JEOL, Япония) в Х-диaпазоне. Условия измерения: СВЧ мощность 1 мBт, частота микроволнового излучения 9144 МГц, амплитуда высокочастотной модуляции 0,1 мТл. Образцы измеряли в кварцевой ампуле (5 мм), масса навески в зоне резонатора составляла 0,03 г.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программного обеспечения «Statistica 10 version» фирмы «StatSoftInc.». Данные взвешивания крыс и измерения размеров наночастиц серебра выражали путем расчета среднего (M) и стандартного отклонения (SD), в виде M±SD. Полученные результаты исследуемых групп после статистической обработки выражали в виде медианы (Me) с использованием 25 и 75 процентилей (p25 и p75). Для проверки гипотезы о гауссовом распределении показателей в исследуемых группах использовали критерий Шапиро – Уилка. В связи с тем, что распределение значений исследуемых показателей в группах отличалось от нормального, их сравнение проводилось по непараметрическому критерию Манна – Уитни (Utest), с установлением уровня значимости *p≤0,01.

Результаты и их обсуждение

В течение всего периода работы случаев выведения животных из исследования не было. При осмотре внешний вид и поведение крыс в группах № 1 и № 2 видимых отличий не имели. На момент окончания эксперимента средняя масса крыс в группе № 1 составила 148±8 грамм, а в группе № 2 – 150±6 грамм, при этом статистически значимых отличий между группами не выявлено (p≥0,01).

По данным электронной микроскопии наночастицы серебра имели сферическую форму и средний размер 12,5 ± 2,5 нм. В нашей работе мы сосредоточились на исследовании биологических свойств низких концентраций наносеребра при его хроническом пероральном поступлении в организм крыс, в условиях именно свободного спаивания его раствора (ситуация, по нашему мнению, наиболее приближенная к реальной). Дк за период исследования (30 дней) составила 8,2±0,96 мг/кг, что на порядок ниже в сравнении с работами аналогичного профиля [3-5, 8, 16, 23, 32].

Данные масс-спектрометрии показывают, 30-дневное употребление питьевой воды с концентрацией наночастиц серебра 5 мг/л приводит к статистически значимому (p=0,0001≤0,01), в сравнении с контролем, увеличению содержания серебра во внутренних органах крыс из группы № 2. Содержание серебра возрастает в почках в 94 раза, головном мозге в 58 раз, тонком кишечнике в 32,5 раз, селезенке – 21,8 раз, печени – 15,6 раз, сердце в 4,4 раза крыс, что отражает выраженные кумулятивные свойства наночастиц серебра (табл. 1).

Таблица 1

Содержание серебра во внутренних органах крыс из групп № 1 и № 2

ЭПР-спектроскопия показывает, содержание свободных радикалов в головном мозге (на 22,6 %), печени (на 29,5 %) и сердце (на 88,1 %) снижается (p=0,0001≤0,01), в тонком кишечнике достоверно не меняется (p=0,0140≥0,01), а в селезенке (на 92,3 %) и почках (на 51,3 %) значительно возрастает (p=0,0001≤0,01) (табл.2).

К моменту окончания эксперимента содержание серебра в ткани мозга возрастает в 58 раз, но в то же время, по данным ЭПР-спектроскопии, содержание свободных радикалов в нем снижается практически на 22,6 %. Основываясь на полученных данных, можно сделать предположение о наличии антиоксидантных свойствах наносеребра. О значительных кумулятивных свойствах наноразмерного серебра в отношении ткани головного мозга было известно и ранее [11]. Однако в большинстве известных литературных источников описывается выраженный прооксидантный эффект наноразмерного серебра. Индукции реакций свободно-радикального окисления, а также активации апоптоза отводится ключевая роль в его нейротоксическом влиянии [6, 17].

Анализируя данные литературы, мы видим, что выводы о нейротоксичности серебра основываются преимущественно на результатах культуральных исследований [19, 32]. В частности показана дозозависимая способность наносеребра, вызывать нарушения в работе ферментов цепи переноса электронов [14]. В то же время известно, что митохондриальную дисфункцию вызывают лишь частицы серебра размером 75 нм, а более мелкие размером 10 нм напротив, запускают нейрональные стресс-протективные пути [13]. Показана способность наносеребра с размером частиц 70 нм к выраженной кумуляции в организме, а также их дозозависимые негативные эффекты на культурах клеток крыс и человека, выявлена значительная модификация негативных свойств серебра при взаимодействии с белками при in vivo применении [9].

Таблица 2

Концентрация парамагнитных центров во внутренних органах исследуемых крыс

Несмотря на то, что серебро из организма в основном выводится с калом, наибольшее его накопление отмечено для почек (рост в 94 раза), при этом содержание свободных радикалов в них также возросло на 51,3 %. Много серебра накапливалось в селезенке (рост в 21,8 раз), при этом содержание свободных радикалов в ней возросло на 92,3 %. Полученные результаты хорошо согласуются с описанными в литературных источниках [20, 28].

В настоящее время не существует единого мнения по вопросу влияния наносеребра на печень. Многие авторы показывают его токсичность, которая проявляется в виде активации процессов свободно-радикального окисления, некроза и апоптоза гепатоцитов, воспалительных изменений в паренхиме печени, а также увеличения содержания маркеров цитолиза в крови [10, 15-18, 23, 28]. Однако существуют исследования, отрицающие токсическое действие даже высоких доз наносеребра [20, 22, 27].

В нашей же работе содержание серебра в печени возрастает в 15,6 раз, что значительно уступает его содержанию в почках, головном мозге, тонком кишечнике и селезенке (табл.1), эту особенность можно объяснить высокой активностью процессов выведения серебра из печени [11, 20]. Содержание свободных радикалов в печени на этом фоне падает на 29,5 % (табл.2). Так как основным поставщиком радикалов в печени является микросомальная система окисления, то можно было бы предположить факт снижения их содержания ее угнетением, однако существуют исследования, отрицающие данную возможность [26]. В то же время имеются работы, показывающие, что наносеребро не только запускает реакции свободно-радикального окисления, но и выступает в качестве стимулятора экспрессии антиоксидантных ферментов [12].

В литературе известно явление выраженного нарушение функции эпителия тонкого кишечника у крыс при употреблении растворов наносеребра вследствие разрушения микроворсинок [30]. В нашей работе, несмотря на увеличение содержания серебра в кишечнике в 32,5 раз, мы наблюдали некоторое снижение содержания свободных радикалов, которое, однако, статистически достоверным не являлось.

К окончанию исследования содержание серебра в сердце крыс возрастало в 4,4 раза, а количество свободных радикалов, напротив, снижалось на 88,1 %, что показывает выраженные антиоксидантные свойства исследуемого раствора наносеребра, что в целом не соответствует данным литературы [16].

В зависимости от свойств наночастиц серебра, их дозировки, пути и способа применения меняется их проникающая и кумулятивная способность, а также динамика продукции ими ионов серебра, ответственных за его токсические эффекты. Этим объясняется наличие полярных воззрений на сущность биоэффектов, возникающих в организме животных и человека при хроническом пероральном употреблении растворов наносеребра [17, 22, 27, 28].

Заключение

30-дневное употребление крысами питьевой воды с концентрацией наносеребра 5 мг/л приводит к увеличению его содержания в почках в 94 раза, головном мозге в 58 раз, тонком кишечнике в 32,5 раз, селезенке 21,8 раз, печени 15,6 раз и сердце в 4,4 раз. По данным ЭПР-спектроскопии, мы видим, что содержание свободных радикалов в головном мозге на 22,6 %, печени на 29,5 % и сердце на 88,1 % ниже, в тонком кишечнике достоверных изменений не выявлено, а в селезенке на 92,3% и почках на 51,3% оно возрастает.

Таким образом, употребление крысами раствора с концентрацией наносеребра 5 мг/литр и средним размером частиц 12,5 ± 2,5 нм в течение 30 дней характеризуется значительным его накоплением во внутренних органах и разнонаправленными по выраженности изменениями активности процессов свободно-радикального окисления.