Сальмонеллез – кишечное зооантропонозное заболевание, вызываемое микроорганизмами рода сальмонелл, характеризующееся при манифестном течении отчетливо выраженной интоксикационной и гастроинтестинальной симптоматикой, а также возможностью развития в некоторых случаях генерализованной формы [3].
Восприимчивость к сальмонеллезной инфекции повышается при подавлении нормальной флоры кишечника. Заражающей дозой для иммунокомпетентного человека является доза 107 бактерий. Для развития заболевания у иммунокомпрометированных лиц инфицирующая доза может быть значительно меньшей.
Если интенсивность бактериолиза недостаточна, специфический иммунитет отсутствует, а факторы неспецифической защиты желудочно-кишечного тракта несовершенны, сальмонеллы преодолевают эпителиальный барьер тонкой кишки и проникают в толщу тканей (в энтероциты и собственный слой слизистой оболочки кишечника), где захватываются (фагоцитируются) нейтрофилами и макрофагами. Возникает воспалительный процесс во всех отделах ЖКТ (гастроэнтероколитическая форма) [7].
Для развития манифестных форм болезни обязательно проникновение в ЖКТ не только токсинов сальмонелл, но и живых возбудителей. Массивное поступление живых бактерий (при алиментарном пути заражения) сопровождается разрушением их в верхних отделах ЖКТ (в желудке и преимущественно в кишечнике), в результате чего высвобождается большое количество эндотоксина, который, всасываясь в кровь, обусловливает возникновение эндотоксического синдрома, определяющего клиническую картину начального периода заболевания. Сальмонеллы, попадая с током крови в различные органы и ткани, размножаются с формированием септических очагов поражения (септическая форма) [6].
Токсины сальмонелл вызывают активацию синтеза простагландинов и циклических нуклеотидов, что приводит к резкому усилению секреции жидкости и ионов калия и натрия в просвет желудочно-кишечного тракта. Развивается диарея с последующими нарушениями водно-электронного баланса. Общая реакция организма на эндотоксины характеризуется нарушением функционально-адаптивных процессов во многих органах и системах [4; 5].
В связи со снижением эффективности антибиотиков и химиопрепаратов, а также невысокой эффективностью действия пробиотиков в настоящее время чрезвычайно актуальным является сочетанное применение антибиотических и пробиотических препаратов.
Исходя из выше перечисленного перед нами была поставлена следующая цель исследования: определение эффективности совместного применения пробиотиков на основе бактерий рода Bacillus с антибиотиками при экспериментальной инфекции.
Эксперимент выполнялся с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкской декларации и в соответствии с требованиями правил проведения работ с использованием экспериментальных животных. В качестве биологического тест-объекта использовали белых половозрелых крыс массой от 180 до 200 граммов. Длительность эксперимента составила 10 дней. В соответствии с поставленными задачами животные разбивались на 14 групп по 9 животных в каждой группе.
Были сформированы группы лабораторных животных: К0 - обычный рацион; К1 - заражение S. enteritidis; К2 - Ветом 2; К3 - Споробактерин; К4 - Бактисубтил; О1 - заражение + Хлорамфеникол; О2 - заражение + Цефотаксим; О3 - заражение + Пенициллин; О4 - заражение + Ветом 2; О5 - заражение + Споробактерин; О6 - заражение + Бактисубтил; О7 - заражение + Ветом 2 + Цефотаксим; О8 - заражение + Споробактерин + Хлорамфеникол; О9 - заражение + Бактисубтил + пенициллин.
Убой животных проводился в количестве трех голов на каждой точке исследований для определения эффективности применения исследуемых препаратов. В качестве точек исследования были установлены следующие сроки: фоновое исследование перед применением препаратов, на пятый и на десятый день после начала эксперимента. Заражение лабораторных животных проводилось однократно перорально по 0,2 мл смыва суточной агаровой культуры возбудителя сальмонеллеза Salmonella enteritidis, содержащей 1,5 × 106 микробных клеток. Введение пробиотиков и антибиотиков проводилось в соответствии с аннотацией к препарату. Введение препаратов в опытных группах проводилось через 12 часов с момента заражения, утром задавались антибиотики, вечером пробиотики.
От исследуемых лабораторных животных брали кровь на морфологический анализ и определение лизоцимной и β-литической активности; экскременты для выделения бацилл и сальмонелл, органы-мишени (кишечник и селезенка) на гистологическое исследование.
Для определения влияния комплексного применения антибиотиков и пробиотиков на основе бактерий рода Bacillus на течение сальмонеллезной инфекции in vivo нами использовались следующие методы: определение колониеобразующих единиц из фекалий экспериментальных животных Bacillus и S. enteritidis; методы общего морфологического и биохимического анализа крови [2]; гистологический метод исследования органов и тканей лабораторных крыс [1].
Для выделения Bacillus из экскрементов применялась среда МПА. Предварительно исследуемый материал подвергался термической обработке путем кипячения в течение 10 минут при 100 °C. Для выделения Salmonella enteritidis использовалась среда ВСА. Данные представлены в таблицах 1 и 2.
Таблица 1
Результаты подсчета колониеобразующих единиц Bacillus в экскрементах лабораторных животных, КОЕ
Исследуемые группы |
Сроки исследования (2-10 день исследования от начала эксперимента) |
||||||||
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
|
К2 |
30 |
50 |
100 |
170 |
220 |
240 |
260 |
310 |
380 |
К3 |
24 |
31 |
67 |
82 |
131 |
157 |
204 |
260 |
301 |
К4 |
21 |
42 |
56 |
78 |
64 |
119 |
147 |
181 |
210 |
О4 |
31 |
44 |
74 |
107 |
138 |
202 |
240 |
290 |
320 |
О5 |
19 |
33 |
51 |
84 |
120 |
165 |
201 |
231 |
270 |
О6 |
17 |
34 |
42 |
57 |
91 |
110 |
136 |
181 |
201 |
О7 |
22 |
32 |
41 |
87 |
101 |
119 |
131 |
153 |
172 |
О8 |
18 |
25 |
39 |
43 |
62 |
94 |
118 |
131 |
141 |
О9 |
15 |
29 |
39 |
54 |
74 |
83 |
91 |
102 |
136 |
Из таблицы 1 видно, что наибольшее КОЕ Bacillus отмечалось в контрольных группах, где применялся Ветом 2 и Споробактерин, а также в группе О4, где производилось заражение и задавался Ветом 2.
Таблица 2
Результаты подсчета колониеобразующих единиц Salmonella enteritidis в экскрементах лабораторных животных, КОЕ
Исследуемые группы |
Сроки исследования (2-10 день исследования от начала эксперимента) |
||||||||
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
|
К1 |
31 |
43 |
57 |
87 |
96 |
150 |
212 |
261 |
286 |
О1 |
19 |
36 |
41 |
28 |
13 |
0 |
0 |
0 |
0 |
О2 |
28 |
37 |
48 |
31 |
22 |
8 |
0 |
0 |
0 |
О3 |
26 |
34 |
51 |
42 |
19 |
10 |
0 |
0 |
0 |
О4 |
23 |
29 |
49 |
33 |
18 |
7 |
0 |
0 |
0 |
О5 |
24 |
37 |
45 |
39 |
26 |
11 |
0 |
0 |
0 |
О6 |
22 |
29 |
44 |
51 |
31 |
22 |
9 |
0 |
0 |
О7 |
27 |
31 |
37 |
26 |
12 |
0 |
0 |
0 |
0 |
О8 |
25 |
33 |
42 |
29 |
23 |
14 |
0 |
0 |
0 |
О9 |
24 |
35 |
45 |
37 |
20 |
7 |
0 |
0 |
0 |
Наибольшее КОЕ наблюдается в контрольной группе, где проводилось только заражение. Что касается остальных групп, то КОЕ на 2-й и 3-й день во всех группах оставалось примерно одинаковое, а затем происходил подъем КОЕ в группе О1 (Споробактерин+заражение). К шестому, седьмому, восьмому, девятому дню показатели КОЕ в опытных группах уменьшаются по сравнению с контрольными значениями (К1).
Для гистологического исследования производили отбор образцов тонкого отдела кишечника и селезенки. Обработка гистоматериала, получение и окрашивание гистопрепаратов производили по традиционной методике.
В тонком кишечнике производились следующие замеры: диаметр гемокапилляров крипт и ворсинок, высота ворсинок, диаметр энтероцитов ворсинок, диаметр ядер энтероцитов ворсинок, диаметр крипт, диаметр энтероцитов крипт, диаметр ядер энтероцитов крипт. Полученные данные изменяются достоверно внутри группы относительно фонового значения [1].
В группах О4, О5, О6 патологические изменения в слизистой оболочке минимальны, сосудистая реакция сводится к полнокровию ее сосудов. Подслизистая основа слизистой оболочки инфильтрируется лимфоцитами, скопление которых происходит преимущественно вокруг сосудов. Строение ворсинок и крипт в норме.
В группах О1, О2 местами наблюдались отёк и кровоизлияния, повышенная секреция эпителия крипт, массовое слущивание эпителия, который скапливается в расширениях желез вместе со слизью и лейкоцитами. Местами наблюдается вакуолизация энтероцитов крипт. Ворсинки имеют характерное для нормы строение. В группе О3 изменения в слизистой минимальны. Сосудистая реакция сводится к полнокровию сосудов поверхностных слоёв слизистой оболочки, чаще в области ворсинок. В группе О7 изменения в слизистой минимальны. Признаки патологии отсутствовали. Целостность ворсинок сохранена. Крипты удлинённой формы без признаков отечности. Микрососуды имеют нормальные структуры и степень наполненности. В группе О8, О9 изменения в слизистой минимальны. Признаки патологии отсутствовали, имелся небольшой отёк стромы. Крипты незначительно расширены. Ворсинки имели нормальные размеры.
На пятый день исследования в группе К1 на всем протяжении слизистой оболочки кишечника выражены: гиперемия, кровоизлияния и периваскулярные отеки. Хорошо просматривались лимфоидные образования в подслизистом слое, в которых имеются точечные кровоизлияния и периваскулярные отеки [1].
В группах К2, К3, К4 признаки патологии отсутствовали. Сосудистая реакция сводится к полнокровию сосудов поверхностных слоев слизистой оболочки. Сохраняется целостность ворсинок, в которых хорошо развита соединительнотканная основа и микрососуды.
В опытных группах О4 изменения в слизистой оболочке кишечника минимальны. Сосудистая реакция сводится к полнокровию сосудов (венул) в области основания ворсинок. Сосуды паретически расширены, с тромбами. Ворсинки сохраняют нормальную структуру, численность бокаловидных энтероцитов в эпителии также в пределах нормы.
На финальном этапе исследования в опытных группах О1, О2 на всем протяжении слизистой оболочки выражены: отёки, кровоизлияния, гиперемия, поверхностный некроз и изъязвления слизистой оболочки. Лимфоидные образования слизистой хорошо выражены, полнокровны, имеют набухший вид. В области крипт повышенная секреция, слущивание эпителия.
В группах О7, О8, О9 изменения в слизистой оболочке минимальны. Сосудистая реакция сводится к полнокровию сосудов (венул) поверхностных слоев слизистой оболочки, чаще в области ворсинок. Последние имеют правильную структуру, все виды энтероцитов без признаков патологии. Крипты правильно удлинённой формы, имеют просветы. Признаков отёчности не наблюдается.
В группе К0 изменений не происходило. В группе К1 на всем протяжении слизистой оболочки кишечника отёк, кровоизлияния, гиперемия, поверхностный некроз и изъязвления слизистой оболочки. Лимфоидные образования слизистой хорошо выражены, имеют набухший вид, полнокровные сосуды, имеются точечные кровоизлияния. Ворсинки укороченные, основа их истончена. Регистрировалась массовая вакуолизация эпителия ворсинок и лизис мембран энтероцитов крипт. Наблюдалась слабая базофилия и выраженная вакуолизация энтероцитов крипт. В комплексе ворсинка-крипта нарушена регенерация эпителия.
На всех сроках исследования во всех исследуемых группах изменения в гистологии селезенки не были выявлены (рисунок А, Б). Во всех случаях селезенка полнокровна на всем поле препарата.
А Б
Селезенка (окрашивание гематоксилином):
А – тельце Мальпиги, Б – мышечная трабекула; увеличение в 600 раз
В селезенке проводились замеры (табл. 3): диаметра мальпигиевых телец, отношении красной пульпы к белой, диаметр трабекулы, диаметр эксцентричной артерии, толщина капсулы. Значения изменяются достоверно внутри группы относительно фонового значения.
При экспериментально созданной лабораторной инфекции, в частности сальмонеллезе, патоморфологические изменения в слизистой оболочке кишечника крыс эффективно снимает применение пробиотика биоспорина и его сочетания с антибиотиком цефотаксимом. Менее эффективно снимает применение пробиотика споробактерина и его сочетания с хлорамфениколом. Наименьший эффект оказывает применение пробиотика бактисубтила и его сочетания с пенициллином.
Таблица 3
Толщина капсулы селезенки лабораторных крыс, нанометры
Исследуемые группы |
Сроки исследования |
||
Фоновое |
Через 5 суток |
Через 10 суток |
|
Толщина капсулы |
|||
К0 |
28,33±0,621 |
28,36±0,639* |
28,87±1,007*** |
К1 |
22,08±1,496 |
20,08±0,964 |
19,50±0,625* |
К2 |
21,45±1,739 |
20,70±1,950** |
19,37±0,934 |
К3 |
23,25±1,332 |
23,11±1,516 |
24,59±1,964** |
К4 |
27,82±1,465 |
27,90±0,822 |
30,25±0,478 |
О1 |
27,98±1,463 |
27,68±0,899 |
20,94±0,780* |
О2 |
27,10±1,393 |
21,87±1,109** |
23,78±1,569*** |
О3 |
25,60±1,164 |
20,89±0,796 |
26,66±1,393* |
О4 |
27,54±0,658 |
26,15±1,104* |
18,69±0,457 |
О5 |
27,16±1,111 |
26,50±0,832 |
20,08±0,575** |
О6 |
25,67±1,678 |
22,70±1,652 |
20,35±0,400* |
О7 |
23,15±1,334 |
23,13±1,142* |
20,64±0,615 |
О8 |
25,07±1,675 |
27,02±1,865 |
22,32±1,251** |
О9 |
27,44±1,783 |
26,78±0,839* |
21,30±0,561** |
* Р < 0,050; ** Р < 0,010; *** Р < 0,001. |
В ходе проведенных исследований крови было установлено, что наиболее значимые и достоверные изменения отмечаются со стороны таких морфологических и гематологических показателей, как лимфоциты, моноциты, лейкоциты, эритроциты [2].
На десятый день только в группе К1 регистрировалось превышение физиологических значений уровня лейкоцитов, данный показатель по отношению к фоновому исследованию был выше на 65,56%, а в группах О3, О4, О6, О9 в пределах верхней границы нормы.
СОЭ к десятому дню исследования превышала значения физиологической нормы и фоновые значения в группах К1, О2, О4, О5, О6 на 104,58, 85,77, 45,57, 92,39, 108,23% соответственно. СОЭ в группах О1, О3, О7, О8, О9 снижается и до пределов верхней границы физиологической нормы [2].
Применение пробиотических препаратов способствует активации показателей неспецифической резистентности, таких как лизоцим и β-лизин. Вскоре после приема исследуемых пробиотических препаратов начинают выделяться биологически активные вещества и функционировать системы микробных клеток, оказывающие как прямое действие на патогенные и условно патогенные микроорганизмы, так и опосредованное – путем активации специфических и неспецифических систем защиты макроорганизма [2].
В ходе проведенных исследований на основании подсчета КОЕ S. enteritidis в фекалиях экспериментальных животных установлено, что наиболее эффективным является совместное применения Ветом 2 с Цефотаксимом; на основании исследования морфологических и гематологических показателей крови было установлено, что комплексное применение антибиотиков и пробиотиков при лечении кишечной инфекции, вызванной S. enteritidis, является эффективным, так как во всех опытных группах исследуемые показатели к десятому дню имеют значения в переделах нормы в отличие от контрольной группы заражения; установлено стимулирующее действие исследуемых пробиотических штаммов на β-литическую и лизоцимную активность сыворотки крови; на основании гистологического исследования органов мишеней установлено, что применение пробиотиков при лечении кишечной инфекции, вызванной S. enteritidis, является эффективным, так как предотвращает развитие патологических изменений.
Библиографическая ссылка
Сизенцов А.Н., Карпова Г.В., Володченко В.Ф., Тимофеева А.А. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ СОВМЕСТНОГО ПРИМЕНЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ // Современные проблемы науки и образования. – 2017. – № 2. ;URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=26173 (дата обращения: 07.12.2024).