Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,006

МИКРОСКОПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТОРМОЗНЫХ ПРОЦЕССОВ В НЕЙРОТРАНСПЛАНТАТАХ

Журавлева З.Н. 1
1 ФГБУН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН
Проведено изучение количества тормозных ГАМК-ергических нейронов и общей нейрональной плотности в неокортикальных трансплантатах и в окружающей соматосенсорной области мозга реципиента через шесть месяцев после трансплантации. Трансплантаты были обнаружены у всех оперированных животных. Для идентификации тормозных клеток использовали метод иммуноцитохимического окрашивания полутонких срезов. Было обнаружено, что по сравнению с контрольным неокортексом в трансплантатах общее число нейронов значительно увеличено. В то же время, популяция тормозных ГАМК-ергических клеток, наоборот, была резко снижена, хотя и наблюдалась некоторая гипертрофия их размеров. Нарушение баланса между возбуждением и торможением в трансплантированной ткани может приводить к развитию патологической активности и формированию эпилептического фокуса. В качестве возможных факторов, приводящих к селективной редукции тормозных нейронов, обсуждается роль частичной деафферентации или бόльшей уязвимости ГАМК-предшественников к временной гипоксии во время процедуры трансплантации.
количественный анализ
иммуноцитохимия
гамк-ергические нейроны
неокортекс
интракортикальные трансплантаты
1. Журавлева З.Н. Ультраструктура синаптических окончаний в трансплантатах нервной ткани, развивающихся в передней камере глаза // Онтогенез. – 1987. – Т. 18. – № 6.– С. 631-638.
2. Журавлева З.Н. Дифференцировка нейронов и синапсов мшистых волокон в трансплантатах зубчатой фасции, развивающихся в неокортексе крыс // Онтогенез. – 1998. –Т. 29. – № 2. – С. 85-91.
3. Журавлева З.Н., Ермаков А.А., Журавлев Г.И. Вовлечение нейропептидных механизмов в процесс интеграции гетеротопических трансплантатов зубчатой фасции с мозгом реципиента // Журн. высш. нервн. деят. – 2007. – Т. 57. – № 2. – С. 205-209.
4. Bragin A., Takács J., Vinogradova O., Zhuravleva Z., Hámori J. Number of GABA-immunopositive and GABA-immunonegative neurons in various types of neocortical transplantats // Exp. Brain Res. 1991. Vol. 85. № 1. P. 114-128.
5. Freund T.F., Buzsàki G. Alterations in excitatory and GABA-ergic inhibitory connections in hippocampal transplants // Neuroscience. 1988. Vol. 27. P. 373-385.
6. Ishii T., Eto K. Fetal stem cell transplantation: Past, present, and future // World J. Stem Cells. 2014. Vol. 6. № 4. P. 404-420.
7. Markram H., Toledo-Rodriguez M., Wang Y. et al. Interneurons of the neocortical inhibitory system // Nat. Rev. Neurosci. 2004. Vol. 5. № 10. P. 793–807.
8. Popp A., Urbach A., Witte O.W. et al. Adult and embryonic GAD transcripts are spatiotemporally regulated during postnatal development in the rat brain // PLoS One. 2009. Vol. 4. № 2: e4371.
9. Weibel E.R., Kistler G.S., Scherle W.F. Practical stereological methods for morphometric cytology // J. Cell Biol. 1966. Vol. 30. № 1. P. 23–38.
10. Zhuravleva Z.N., Vinogradova O.S. // Intracortical dentate fascia grafts: mossy fiber synapses in the host neocortex // J. Neural Transpl. Plasticity. 1994. Vol. 5. № 3. P. 169-182.

Центральная нервная система млекопитающих обладает очень ограниченной способностью к регенерации. Это является серьезным препятствием для восстановления нормального функционирования мозга после повреждения в результате травм или нейродегенеративных заболеваний. Показано, что нейротрансплантация в поврежденный мозг кусочков фетальной ткани или нейральных клеток-предшественников оказывает позитивное воздействие на его регенеративные способности. Недифференцированные трансплантированные клетки продолжают свое развитие, воспроизводят основные морфологические и физиологические свойства, интегрируются с мозгом реципиента и замещают поврежденные структуры [2, 6, 10]. Ранее мы показали, что воспроизведение органотипических характеристик донорских тканей сохраняется даже при интраокулярной трансплантации [1]. Однако морфологическая и функциональная изоляция трансплантатов от других структур мозга приводит к формированию в них патологической электрофизиологической активности [5]. Аномалии функциональных процессов в трансплантированной ткани могут зависеть от нарушения соотношения возбудительных и тормозных нейронов. Общеизвестно, что основным тормозным медиатором в ЦНС млекопитающих является гамма-аминомасляная кислота (ГАМК). Целью настоящей работы было изучение числовой плотности тормозных ГАМК-ергических нейронов в неокортикальных трансплантатах, а также оценка их соотношения с нейронами другой нейромедиаторной природы.

Материалы и методы исследования

Эксперименты были выполнены на крысах породы Вистар с соблюдением требований к работе с животными (ГОСТ Р ИСО 10993-2-2009). Материалом для трансплантации служили эмбриональные закладки соматосенсорного неокортекса, выделенные из мозга 17-дневных плодов крыс. Для извлечения плодов самке-донору под глубоким нембуталовым наркозом (40 мг/кг) делали кесарево сечение. В качестве реципиентов использовали половозрелых крыс-самцов той же породы (n = 5), которым также делали общий нембуталовый наркоз и дополнительно локальную анестезию новокаином. Трансплантацию производили через отверстие в кости черепа в области первичной соматосенсорной коры и прокол в твердой мозговой оболочке. С помощью туберкулинового шприца со стеклянным наконечником в отверстие вводили кусочек эмбриональной ткани объемом около 1 мм³. Через 6 месяцев после трансплантации животных транскардиально перфузировали фиксирующим раствором (смесь 2.5% параформальдегида и 1% глутаральдегида на 0.1 М фосфатном буфере при pH 7.2). Интрамозговые трансплантаты выделяли из мозга вместе с окружающим неокортексом, который служил в качестве контроля. Затем материал постфиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия и заливали в эпоксидную смолу Эпон 812 по общепринятой методике. На ультрамикротоме из каждого эпонового блока через 50 мкм приготавливали пары полутонких срезов толщиной 1 мкм, один из которых окрашивали толуидиновым синим для рутинной гистологии и для подсчета общего числа нейронов, а следующий срез подвергали иммуноцитохимическому окрашиванию на ГАМК. Для количественной оценки плотности и размеров ГАМК-положительных (ГАМК+) и ГАМК-отрицательных (ГАМК-) клеток в трансплантатах и в контрольном неокортексе использовали компьютерную программу UTHSCSA Image Tool. Подсчет и измерение диаметров ядер и перикарионов производили на 10 случайно выбранных участках каждого среза. Числовую плотность клеток в единице объема (1 мм³) вычисляли по формуле, предложенной Вайбел с соавторами для эллипсоидов [9]. Такой стереологический подход для подсчета клеток применялся нами ранее; в настоящей работе использованы некоторые цифровые данные, полученные в предыдущем исследовании [4]. Статистическую значимость различий определяли по t-критерию Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

Визуальный и микроскопический анализ через 6месяцев после операции показал, что трансплантаты сохранились у всех оперированных животных. На гистологических срезах было видно, что все трансплантаты увеличили свои размеры; нервные клетки содержали выраженные ядра и дифференцированную цитоплазму. Однако нейроны располагались диффузно, без типичной для неокортекса колончатой организации клеточных элементов (рис.1).

Рис. 1. Полутонкий гистологический срез с эпонового блока через интранеокортикальный трансплантат (Т) и окружающий неокортекс реципиента (Н). Стрелки указывают на границу между трансплантатом и мозгом. Окраска толуидиновым синим

Граница между самим трансплантатом и соседним неокортексом реципиента хорошо идентифицировалась благодаря проникающим в эту зону кровеносным сосудам. Кроме того, окружающая неокортикальная ткань выделялась более упорядоченным расположением нейронов и параллельно расположенным апикальным дендритам, направленным к поверхности мозга. Нарушением органотипической клеточной организации неокортикальные трансплантаты отличались от изученных нами ранее трансплантатов зубчатой извилины гиппокампа, в которых при идентичном типе трансплантации формировался выраженный слой гранулярных нейронов [1, 10].

После проведения иммунохимической реакции на ГАМК в срезах, содержащих нейротрансплантат и окружающий его неокортекс, были выявлены ГАМК-позитивные нейроны. Общая микроскопическая оценка препаратов показала, что ГАМК-ергических нейронов в трансплантатах значительно меньше, чем в интактной неокортикальной ткани. Иммунореактивные нейроны имели овальную, мультиполярную или пирамидоподобную форму. Метка коричневого цвета была гомогенно распределена по всему клеточному телу; ядра выглядели более светлыми. В план среза некоторых нейрональных перикарионов входили позитивно окрашенные нервные отростки. Кроме того, были видны ГАМК(+) фрагменты отростков, перерезанные в разных направлениях, которые выглядели как точечные включения или прерывистые и изогнутые линии. Яркие иммунопозитивные вкрапления также обнаруживались на поверхности ГАМК(-) нервных клеток и их дендритов (рис. 2).

Рис. 2. Группа ГАМК-иммунопозитивных нейронов в неокортикальном трансплантате. Масштаб: 25 мкм.

По-видимому, ГАМК(+) микроструктуры в виде точек могут представлять собой синаптические окончания тормозных интернейронов. Интенсивность реакции в разных ГАМК-ергических нейронах несколько варьировала, что, по-видимому, было следствием их разного биохимического или функционального состояния. Известно, что в процессе развития нейронов, а также при пластических и некоторых патологических состояниях биосинтез ГАМК в нейронах может изменяться за счет активации альтернативных изоформ синтезирующих ферментов [8].

Количественный анализ общей числовой плотности нейронов, проведенный на гистологических препаратах, окрашенных толуидиновым синим, показал, что в кубическом миллиметре трансплантированной ткани содержится нервных клеток достоверно больше, чем в контрольном неокортексе реципиента (75393 ±9127 и 41708±7816, соответственно; различия при p ≤ 0.0001). В то же время количество ГАМК-ергических нейронов, наоборот, в трансплантатах было значительно меньше (959±674 против 5605±1353, p ≤ 0.0001). По-видимому, помимо высоких ростовых потенций эмбриональной ткани, для развития нейрохимического фенотипа нервных клеток требуются и другие факторы, такие как соответствующее микроокружение и адекватная иннервация. Возможное объяснение нарушения дифференцировки ГАМК-позитивных клеток может заключаться и в том, что их предшественники более чувствительны к временной гипоксии во время процедуры трансплантации.

При сравнительном морфометрическом исследовании размеров нейронов и их ядер в неокортикальных трансплантатах и контрольном неокортексе также были прослежены интересные закономерности. Размеры ГАМК-отрицательных клеток анализировали лишь по ядрам, так как в материале, залитом в эпоксидную смолу, определить границы цитоплазмы не представлялось возможным. Измерения диаметров ядер ГАМК-отрицательных клеток не дали различий по этому параметру между двумя типами изученных тканей; их средние значения были практически одинаковыми (8.5±0.7 мкм в трансплантатах и 8.6±0.5 мкм в соседнем неокортексе). Однако ядра ГАМК-позитивных нейронов в трансплантированной ткани достоверно отличались от таковых в ткани реципиента бóльшими размерами. Если в трансплантатах они равнялись 11.9±1.4 мкм, то в контрольных образцах они достигали лишь 9.5±1.5 мкм (p ≤ 0.005). В таком же соотношении были различия и в поперечных размерах тел ГАМК(+) клеток (21.1±1.9 мкм в трансплантатах и 16.7±1.6 мкм в коре реципиента (p ≤ 0.005). По-видимому, увеличение размеров ГАМК-ергических нейронов в условиях трансплантации является некой компенсацией снижения их числа.

Значительное уменьшение числа ГАМК-ергических клеток в интрамозговых нейротрансплантатах, несомненно, отражается на функционировании сформированных в них нейрональных сетей. ГАМК-содержащие клетки в неокортексе являются тормозными интернейронами. По данным литературы в разных отделах мозга грызунов они составляют 10 - 25% от всех нервных клеток, что гарантирует физиологический баланс между возбуждением и торможением [7]. Наши результаты показали, что на долю тормозных нейронов в трансплантатах приходится лишь 1.4%. Снижение тормозных процессов в нейротрансплантатах может сопровождаться гипервозбуждением и развитием патологической эпилептической активности. По-видимому, к снижению числа ГАМК(+) нейронов приводит недостаток нормальных афферентно-эфферентных связей между трансплантатами и мозгом реципиента. Ранее мы показали, что в снижении возбуждающего действия глютаминовой кислоты при формировании синаптических взаимодействий между нейротрансплантатом и мозгом участвуют нейропептидные котрансмиттеры [3].

Заключение

В работе проведено гистологическое и иммунохимическое исследование клеточного состава трансплантатов неокортекса и ткани мозга реципиента, окружающей их. Обнаружено, что в трансплантатах не воспроизводится колончатая архитектоника, свойственная соматосенсорной области коры. Сравнительный количественный анализ показал значительное увеличение общей числовой плотности нейронов и, наоборот, снижение количества тормозных нейронов, содержащих в качестве нейротрансмиттера ГАМК, в трансплантированной ткани. Это, несомненно, может приводить к нарушению тормозных процессов в трансплантированной ткани. Во избежание того, чтобы нейротрансплантат стал источником гипервозбуждения и фокусом эпилептической активности, при использовании трансплантации в медицинской практике необходимо учитывать результаты, полученные в настоящем исследовании.


Библиографическая ссылка

Журавлева З.Н. МИКРОСКОПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТОРМОЗНЫХ ПРОЦЕССОВ В НЕЙРОТРАНСПЛАНТАТАХ // Современные проблемы науки и образования. – 2016. – № 5. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=25277 (дата обращения: 19.03.2024).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1,674