Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Данилко К.В. 1 Богданова Р.З. 2 Фатыхова А.И. 3 Куватова Д.Н. 1 Исхакова Г.М. 1 Викторова Т.В. 1, 4

---

1 ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России

2 ГБУЗ Республиканская клиническая больница им. Г.Г. Куватова

3 ГБУЗ РБ ГДКБ № 17 г. Уфы

4 ФГБУН РАН Институт биохимии и генетики УНЦ РАН

Проведена оценка роли полиморфных вариантов генов цитокинов TNF, LTA, IL1B, IL1RN в развитии наследственной предрасположенности к дыхательным расстройствам у новорожденных. Образцы ДНК 108 новорожденных с дыхательными расстройствами (респираторным дистресс-синдромом (РДС) и врожденной пневмонией (ВП)) и 104 здоровых новорожденных использовались для генотипирования методами ПЦР и рестрикционного анализа по полиморфным локусам TNFα*-308G>A, LTA*+252A>G, IL1B*-511C>T, IL1B*+3953C>Т, IL1RN*VNTR. Установлено, что предрасположенность к развитию РДС маркирует гаплотип IL1B*-511T-IL1B*3953Т-IL1RN*A2 (OR=17.13). Маркером устойчивости к развитию РДС является гаплотип IL1B*-511T-IL1B*3953Т-IL1RN*A1 (OR=0.068). Предрасположенность к инфекционным осложнениям РДС маркирует аллель *А1 (OR=3.38) и генотип А1А1 минисателлитного локуса гена IL1RN (OR=3.53). Маркерами устойчивости к возникновению инфекционных осложнений РДС являются генотип АА локуса TNFα*-308G>A (OR=0.06), а также гаплотип TNFα*-308A-LTA*252A (OR=0.069), аллель *А2 минисателлитного локуса гена IL1RN (OR=0.37) и гаплотип IL1B*-511С-IL1B*3953T-IL1RN*А2 (OR=0.035). Установлено, что полиморфные варианты генов цитокинов TNFα, IL1B, IL1RN, являются важными генетическими компонентами мультифакториальной структуры РДС и ВП новорожденных.

Статья в формате PDF

163 KB

респираторный дистресс-синдром

врожденная пневмония

полиморфизм генов

цитокины

1. Актуальные проблемы неонатологии / Под ред. Н.Н. Володина. М.: ГОЭТАР-МЕД. 2004. – 448 с.

2. Фомичев М.В. Сурфактант и его клиническое применение [Электронный ресурс] / Сайт Неонатология. Электрон. Дан. 2004. URL: http://www.neonatology.ru.

3. Шабалов Н.П. Неонатология: Учебное пособие: В 2 т./ Шабалов Н.П. Т. 1. М.: МЕДпресс-информ. 2004. – 608 с.

4. Chen W.C., Wu H.C., Chen H.Y. et al. Interleukin-1beta gene and receptor antagonist gene polymorphisms in patients with calcium oxalate stones // Urol. Res. 2001. Vol. 29, №5. P.321-324.

5. Day C., Grove J., Daly A. et al. Tumor necrosis factor-alpha gene promoter polymorphism and decreased insulin resistance // Diabetologia. 1998. Vol. 41. P. 430–434.

6. Hurme M., Santtila S. IL-1 receptor antagonist (IL-1RA) plasma levels are co-ordinately regulated by both IL-1RA and IL-1 genes // Eur. J. Immunol. 1998. Vol. 28. P. 2598–2602.

7. Kang J.H., Lee J.J., Cho S.I. et al. Association of interleukin-1α-889, β-31, β-511 polymorphism with risk of bronchopulmonary dysplasia // Neonatal. Med. 2013. Vol. 20. № 4. P. 413–414.

8. Messer G., Spengler U., Jung M.C. Polymorphic structure of the tumor necrosis factor (TNF) locus: An NcoI polymorphism in the first intron of the human TNF-beta gene correlates with a variant amino acid in position 26 and a reduced level of TNF-beta production // J. Exp. Med. 1991. Vol. 3. P. 209.

9. Patwari P.P., O’Cain P., Goodman D.M. et al. Interleukin-1 receptor antagonist intron 2 variable number of tandem repeats polymorphism and respiratory failure in children with community-acquired pneumonia // Pediatr. Crit. Care Med. 2008. Vol. 9. №6. Р.553–559.

10. Treszl A., Toth-Heyn P., Kocsis I., Nobilis A., Schuler A., Tulassay T., Vasarhelyi B. Interleukin genetic variants and the risk of renal failure in infants with infection // Pediatr. Nephrol. 2002. Vol. 17. — P. 713–717.

11. Schwartz D.A. The Genetics of Innate Immunity // Chest. 2002. — Vol. 121. — P. 62–68.

12. Warzocha K., Ribeiro P., Bienvenu J. et al. Genetic polymorphisms in the tumor necrosis factor locus influence non-Hodgkin's lymphoma outcome // Blood. 1998. Vol. 91. — P. 3574–3581.

13. Wilson A.G., Symon J.A., McDowel T.L. et al. Effects of a polymorphism in the human tumor necrosis factor alpha promoter on transcriptional activation // Proc. Natl. Acad. Sci. 1997. — Vol. 94. — P. 3195–3199.

В основе РДС лежит нарушение функции сурфактанта, что может быть связано с дефицитом или дефектом его продукции, инактивацией или усилением деградации. Вторичный дефицит сурфактанта наблюдается и в случае развития ВП. Нарушение состава и количества сурфактанта связано со снижением его защитной функции и возникновением воспаления [2]. Пневмонию диагностируют примерно у 0,5-1% доношенных и 10-15% недоношенных новорожденных. По данным литературы, пневмонию на секции выявляют у 15-38% мертворожденных и 20-32% умерших живорожденных детей [3].

В патогенезе расстройств дыхания чрезвычайно важна роль иммунной системы в ранней постнатальной адаптации, а клиническое состояние ребенка в этот период может быть обусловлено нарушением баланса про- и противовоспалительных цитокинов. Защита на местном уровне развивается путем формирования типичной воспалительной реакции в ответ на повреждение и проникновение в ткани патогенов при участии интерлейкинов (IL) 1, 6, 8, фактора некроза опухоли a (TNFa), лимфотоксина альфа (LTA) и др. [1].

Известно, что интенсивность синтеза цитокинов обусловлена генетически. На сегодняшний день описан полиморфизм генов многих цитокинов [13]. Показано, что варианты генов цитокинов ассоциированы с восприимчивостью к аутоиммунным, аллергическим и инфекционным заболеваниям, особенностями и тяжестью их течения, а также с повышенным или, напротив, пониженным содержанием продуцируемых цитокинов [11].

Гены TNFα и LTA, кодирующие соответствующие цитокины TNFa и LTA, сцеплены на хромосоме 6. На линиях В-клеток человека было показано, что полиморфизм -308G>A ассоциирован с повышенной экспрессией гена TNFα in vitro: присутствие аллеля А связано с вдвое повышенной продукцией цитокина по сравнению с аллелем G [13].

В исследовании Messer G. с соавторами была выявлена ассоциация аллеля G полиморфизма +252G>А гена LTA с повышенным уровнем экспрессии LTA в периферических моноцитах крови в результате повышения уровня транскрипции гена [8]. Этот полиморфизм недостаточно изучен при различных заболеваниях легких.

Гены IL1B и IL1RN картированы на длинном плече хромосомы 2 в области 2q14. Для промоторной области гена IL1B описана замена С на T -511 положении. Кроме того, известен полиморфизм IL1B*3539С>T в 5 экзоне, причем его аллель T ассоциирован с более высокой продукцией цитокина [6].

Для гена IL1RN описан минисателлитный полиморфизм во 2-м интроне - вариабельность по числу 86-членных тандемных повторов. Hurme et al. (1998) было показано, что аллель IL1RN*A2 коррелирует с более высоким уровнем рецепторного анатогониста IL1 в плазме, но только в комбинации с аллелем -511T гена IL1B [6].

Цель исследования

Оценить роль полиморфных вариантов генов цитокинов TNFa, LTA, IL1B, IL1RN в развитии наследственной предрасположенности к дыхательным расстройствам у новорожденных.

Материал и методы

Для проведения исследования было получено 108 образцов периферической крови новорожденных детей с дыхательными расстройствами (ДР), собранной во время рутинных манипуляций. Все пациенты находились на лечении в отделении реанимации и интенсивной терапии новорожденных Городской Клинической больницы № 17 г. Уфы. Диагноз устанавливался врачами-неонатологами на основании клинических и рентгенологических данных. Пациентов с РДС оказалось 24 человека, с ВП - 37 и с РДС, осложненным пневмонией, - 47. Среди больных - 62,04% мальчиков и 37,96% девочек. Средний вес младенцев составил 2295±845 г. Средний гестационный возраст больных составил 34,14±3,83 (28-42) недели. В группу сравнения вошли 104 здоровых ребенка первых суток жизни, родившихся в Родильном доме № 8 г. Уфы. Мальчиков в этой группе оказалось 42,3%, девочек - 57,7%. Вес новорожденных составил в среднем 3518±404 г, средний гестационный возраст - 39,18±1,03 недели. Образцы крови  здоровых новорожденных были получены из пуповины немедленно после рождения. Взятие образцов крови проводилось с информированного согласия родителей. ДНК выделяли из лейкоцитов микрометодом фенольно-хлороформной экстракции. Исследование полиморфных локусов TNFα*-308G>A, LTA*+252A>G, IL1B*-511C>T, IL1B*+3953C>Т, IL1RN*VNTR проводили методами ПЦР и/или рестрикционного анализа согласно ранее описанным методикам [4, 5, 12]. Частоты генотипов или аллелей вычисляли в Microsoft Excel. Частоты гаплотипов рассчитывали в программе «The EH software program». Ассоциацию аллелей генотипов и гаплотипов с развитием заболевания выявляли с использованием критерия χ² с поправкой Йетса. Точный двухсторонний тест Фишера использовали в случае суммарного количества индивидов в группах менее 100. Для расчетов использовали программу STATISTICA v.6.0. Статистически значимыми считали различия при p<0,05. Соответствие распределения частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга (χ²) определяли по стандартным формулам при помощи программы BIOSIS-2. Силу ассоциаций маркеров с риском развития ДР оценивали по значениям показателя отношения шансов (OR) и его 95%CI по стандартной формуле в Microsoft Excel.

Результаты

Ни в одной из сравниваемых групп не было выявлено отклонений от равновесия Харди-Вайнберга по частотам генотипов всех изученных локусов. Распределение частот аллелей полиморфных локусов TNFα*-308G>A, LTA*+252A>G, IL1B*-511C>T, IL1B*+3953C>Т, IL1RN*VNTR в группах новорожденных с дыхательными расстройствами и в контроле не различалось (табл. 1).

Таблица 1

Распределение частот редких аллелей генов цитокинов TNFα, LTA,  IL1B,  IL1RN в группах больных с ДР и в контрольной группе

Анализ взаимосвязи полиморфизма генов цитокинов с развитием инфекционных осложнений в виде пневмонии у больных РДС выявил значимые различия в частотах генотипов и аллелей только для локусов TNFα*-308G>A и IL1RN*VNTR (табл. 2). Так, гомозиготный генотип АА полиморфного локуса TNFα*-308G>A ни разу не был отмечен в подгруппе РДС с ВП, а в подгруппе с РДС без ВП обнаружен в 12,5% случаев (p=0,035). Таким образом, для носителей генотипа АА риск развития инфекционных осложнений у новорожденных с РДС снижен (OR=0,06, 95% CI 0,0033-0,55).

С существенно более высокой частотой в подгруппе РДС без ВП встречался аллель *А2 гена IL1RN по сравнению с подгруппой РДС с ВП (p=0,014) (табл. 2). Напротив, аллель *А1 оказался более редким в той же подгруппе (p=0,0028), так же как генотип А1А1 (p=0,023). Таким образом, маркером предрасположенности к развитию инфекционных осложнений  у больных РДС можно считать аллельный вариант *А1 гена IL1RN (OR=3,28, 95% CI 1,43-7,61) и генотип А1А1 (OR=3,53, 95% CI 1,12-11,41). Маркером же устойчивости является аллель *А2 (OR=0,37, 95% CI 0,16-0,87).

Таблица 2

Распределение частот генотипов и аллелей полиморфных локусов генов TNFα и IL1RN у больных РДС в зависимости от наличия осложнения ВП

Поскольку гены TNFα и LTA, а также IL1B и IL1RN попарно сцеплены, нами проведен сравнительный гаплотипический анализ у больных с ДР, РДС, ВП и в контроле (табл. 3).

Таблица 3

Частоты гаплотипов локусов TNFα*-308G>A- LTA*252A>G и IL1B*-511C>T - IL1B*3953C>Т - IL1RN*A1>*A2 у больных с ДР, в подгруппах разного течения РДС, ВП  и контроле

Статистически значимых различий между всеми группами больных и контролем по частотам гаплотипов полиморфных локусов TNFα*-308G>A -LTA*252A>G выявлено не было (p=0,99, p=1,00, p=0,48 соответственно).

Сравнительный анализ встречаемости гаплотипов в подгруппах новорожденных с РДС выявил увеличение доли гаплотипа G-G в подгруппе с РДС с ВП и отсутствие в той же подгруппе носителей гаплотипа А-А (χ²=3,36, p=0,037) (табл. 3). Следовательно, гаплотип А-А является маркером устойчивости к развитию ВП у больных РДС новорожденных (OR=0,069, 95% CI 0,0035-0,57).

Распределение частот гаплотипов полиморфных локусов IL1B*-511C>T, IL1B*3953C>Т, IL1RN*A1>*A2 в группе больных с ДР существенно отличалось от такового в контроле (χ²=18,68, p<0,001). Однако по частотам отдельных гаплотипов наблюдаемые различия не достигли уровня статистической значимости (табл. 3). В то же время группа больных с РДС значимо отличалась от контроля (χ²=21,74, p<0,001) (табл. 3), это было обусловлено повышением доли гаплотипа T-Т-*A2 (p=0,0098) и снижением доли гаплотипа T-Т-*A1 в группе с РДС до 0% против 5,05 %  в контроле (p=0,0079).

Следовательно, аллель *А2 гена IL1RN является маркером предрасположенности к  возникновению РДС, но только в сочетании с двумя аллелями Т локусов -511C>T и 3953C>Т гена  IL1B (OR=17,13, 95% CI 2,28-361,60). Аллель *А1 в свою очередь в сочетании с теми же аллелями гена IL1B связан со сниженным риском развития РДС и является маркером устойчивости (OR=0,068, 95% CI 0,038-0,47).

Общее распределение частот гаплотипических вариантов между подгруппами РДС с пневмонией и без нее значительно различалось: χ²=16.53, p=0.002 (табл. 3). Показано, существенное уменьшение доли гаплотипа С-Т-*А2 (χ²=8,77, p=0,004) в подгруппе РДС с ВП (0%) по сравнению с 12,50% в подгруппе РДС без ВП. Гаплотип IL1B*-511С-IL1B*3953T-IL1RN*А2 может рассматриваться в качестве маркера устойчивости к развитию инфекционных осложнений у больных РДС (OR=0,035, 95% CI 0,0021-0,27).

Обсуждение

Проведенное нами исследование роли полиморфных локусов TNFα*-308G>A, LTA*+252A>G, IL1B*-511C>T, IL1B*+3953C>Т, IL1RN*А1>*А2 в развитии наследственной предрасположенности к дыхательным расстройствам показало, что гаплотип IL1B*-511T-IL1B*3953Т-IL1RN*A2 ассоциирован с повышенным риском развития РДС (OR=17,13, 95% CI 2,28-361,60), а гаплотип IL1B*-511T-IL1B*3953Т-IL1RN*A1 - со сниженным риском (OR=0,068, 95% CI 0,038-0,47). Кроме того, обнаружены маркеры предрасположенности к развитию инфекционных осложнений (ВП) у больных РДС: аллель *А1 и генотип А1А1 VNTR локуса гена IL1RN (OR=3,28, 95% CI 1,43-7,61 и OR=3,53, 95% CI 1,12-11,41 соответственно). Аллель IL1RN *А2 (OR=0,37, 95% CI 0,16-0,87); генотип АА полиморфного сайта TNFα*-308G>A; гаплотипы TNFα*-308A-LTA*252A (OR=0.069, 95% CI 0,003-0,57) и IL1B*-511С-IL1B*3953T-IL1RN*А2 (OR=0,035, 95% CI 0,0021-0,27), напротив, ассоциированы со снижением риска развития ВП у больных РДС новорожденных.

В доступных источниках практически отсутствуют исследования, посвященные исследованию полиморфных локусов генов цитокинов у новорожденных с РДС и ВП. Однако в работе Capasso M. с соавторами в итальянской популяции не было выявлено взаимосвязи полиморфизма TNFα*-308G>A с развитием РДС у недоношенных новорожденных. Еще в одном исследовании показана связь комбинации генотипов по генам  TNFα и IL6 с повышенным риском острого повреждения  почек у детей с инфекцией [10]. Кроме того, вопрос о функциональной значимости полиморфизма генов TNFα и LTA остается открытым. Вследствие этого трудно дать оценку значения показанных нами ассоциаций генотипа АА гена TNFα и гаплотипа А-А  генов TNFα и LTA с устойчивостью к развитию инфекционных осложнений у больных РДС. Кроме того, гены TNFα и LTA расположены между кластерами генов комплекса гистосовместимости (HLA) I и III класса. Вероятно, аллели генов TNFα и LTA находятся в неравновесном сцеплении с некоторыми аллелями генов HLA (около 200 генов), влияющими на развитие аутоиммунных и воспалительных реакций.

По данным Patwari P. с соавторами, в исследовании детей с внебольничной пневмонией отсутствие аллеля *А1 гена IL1RN оказалось ассоциировано с повышенным риском более тяжелого течения, необходимостью в искусственной вентиляции легких, развитием острого повреждения легких или острого РДС. В нашей работе тот же аллель оказался ассоциирован с развитием РДС новорожденных в составе гаплотипа с 2 полиморфными сайтами гена IL1B [9]. В то же время в корейской популяции не было выявлено ассоциации полиморфного сайта IL1B*-511C>T с развитием бронхолегочной дисплазии - осложнения лечения РДС у недоношенных детей повышенными концентрациями кислорода [7]. Вопрос о функциональной значимости полимофизмов генов семейства IL1 также остается дискуссионным [9]. В связи с этим объяснение механизмов влияния полиморфных вариантов генов цитокинов TNFa, LTA, IL1B, IL1RN на развитие самого РДС и его осложнений пневмонией требует проведения дальнейших исследований.

Заключение

Нами показано, что генетические варианты цитокинов TNFa, LTA, IL1B, IL1RN могут занимать определенную место не только в  развитии вариантов течения респираторного дистресс-синдрома у новорожденных, но и играть важную роль в предрасположенности к формированию РДС. Однако для подтверждения полученных нами результатов и оценки возможного влияния других факторов на формирование и степень тяжести РДС необходимы увеличение выборки и проверка полученных результатов на независимой выборке.

Рецензенты:

Хисамов Э.Н., д.б.н., профессор кафедры патологической физиологии, ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России, г. Уфа;

Корытина Г.Ф., д.б.н., доцент, старший научный сотрудник лаборатории физиологической генетики ФГБУН Институт биохимии и генетики УНЦ РАН, г. Уфа.                                                

Библиографическая ссылка