В основе РДС лежит нарушение функции сурфактанта, что может быть связано с дефицитом или дефектом его продукции, инактивацией или усилением деградации. Вторичный дефицит сурфактанта наблюдается и в случае развития ВП. Нарушение состава и количества сурфактанта связано со снижением его защитной функции и возникновением воспаления [2]. Пневмонию диагностируют примерно у 0,5-1% доношенных и 10-15% недоношенных новорожденных. По данным литературы, пневмонию на секции выявляют у 15-38% мертворожденных и 20-32% умерших живорожденных детей [3].
В патогенезе расстройств дыхания чрезвычайно важна роль иммунной системы в ранней постнатальной адаптации, а клиническое состояние ребенка в этот период может быть обусловлено нарушением баланса про- и противовоспалительных цитокинов. Защита на местном уровне развивается путем формирования типичной воспалительной реакции в ответ на повреждение и проникновение в ткани патогенов при участии интерлейкинов (IL) 1, 6, 8, фактора некроза опухоли a (TNFa), лимфотоксина альфа (LTA) и др. [1].
Известно, что интенсивность синтеза цитокинов обусловлена генетически. На сегодняшний день описан полиморфизм генов многих цитокинов [13]. Показано, что варианты генов цитокинов ассоциированы с восприимчивостью к аутоиммунным, аллергическим и инфекционным заболеваниям, особенностями и тяжестью их течения, а также с повышенным или, напротив, пониженным содержанием продуцируемых цитокинов [11].
Гены TNFα и LTA, кодирующие соответствующие цитокины TNFa и LTA, сцеплены на хромосоме 6. На линиях В-клеток человека было показано, что полиморфизм -308G>A ассоциирован с повышенной экспрессией гена TNFα in vitro: присутствие аллеля А связано с вдвое повышенной продукцией цитокина по сравнению с аллелем G [13].
В исследовании Messer G. с соавторами была выявлена ассоциация аллеля G полиморфизма +252G>А гена LTA с повышенным уровнем экспрессии LTA в периферических моноцитах крови в результате повышения уровня транскрипции гена [8]. Этот полиморфизм недостаточно изучен при различных заболеваниях легких.
Гены IL1B и IL1RN картированы на длинном плече хромосомы 2 в области 2q14. Для промоторной области гена IL1B описана замена С на T -511 положении. Кроме того, известен полиморфизм IL1B*3539С>T в 5 экзоне, причем его аллель T ассоциирован с более высокой продукцией цитокина [6].
Для гена IL1RN описан минисателлитный полиморфизм во 2-м интроне - вариабельность по числу 86-членных тандемных повторов. Hurme et al. (1998) было показано, что аллель IL1RN*A2 коррелирует с более высоким уровнем рецепторного анатогониста IL1 в плазме, но только в комбинации с аллелем -511T гена IL1B [6].
Цель исследования
Оценить роль полиморфных вариантов генов цитокинов TNFa, LTA, IL1B, IL1RN в развитии наследственной предрасположенности к дыхательным расстройствам у новорожденных.
Материал и методы
Для проведения исследования было получено 108 образцов периферической крови новорожденных детей с дыхательными расстройствами (ДР), собранной во время рутинных манипуляций. Все пациенты находились на лечении в отделении реанимации и интенсивной терапии новорожденных Городской Клинической больницы № 17 г. Уфы. Диагноз устанавливался врачами-неонатологами на основании клинических и рентгенологических данных. Пациентов с РДС оказалось 24 человека, с ВП - 37 и с РДС, осложненным пневмонией, - 47. Среди больных - 62,04% мальчиков и 37,96% девочек. Средний вес младенцев составил 2295±845 г. Средний гестационный возраст больных составил 34,14±3,83 (28-42) недели. В группу сравнения вошли 104 здоровых ребенка первых суток жизни, родившихся в Родильном доме № 8 г. Уфы. Мальчиков в этой группе оказалось 42,3%, девочек - 57,7%. Вес новорожденных составил в среднем 3518±404 г, средний гестационный возраст - 39,18±1,03 недели. Образцы крови здоровых новорожденных были получены из пуповины немедленно после рождения. Взятие образцов крови проводилось с информированного согласия родителей. ДНК выделяли из лейкоцитов микрометодом фенольно-хлороформной экстракции. Исследование полиморфных локусов TNFα*-308G>A, LTA*+252A>G, IL1B*-511C>T, IL1B*+3953C>Т, IL1RN*VNTR проводили методами ПЦР и/или рестрикционного анализа согласно ранее описанным методикам [4, 5, 12]. Частоты генотипов или аллелей вычисляли в Microsoft Excel. Частоты гаплотипов рассчитывали в программе «The EH software program». Ассоциацию аллелей генотипов и гаплотипов с развитием заболевания выявляли с использованием критерия χ2 с поправкой Йетса. Точный двухсторонний тест Фишера использовали в случае суммарного количества индивидов в группах менее 100. Для расчетов использовали программу STATISTICA v.6.0. Статистически значимыми считали различия при p<0,05. Соответствие распределения частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга (χ2) определяли по стандартным формулам при помощи программы BIOSIS-2. Силу ассоциаций маркеров с риском развития ДР оценивали по значениям показателя отношения шансов (OR) и его 95%CI по стандартной формуле в Microsoft Excel.
Результаты
Ни в одной из сравниваемых групп не было выявлено отклонений от равновесия Харди-Вайнберга по частотам генотипов всех изученных локусов. Распределение частот аллелей полиморфных локусов TNFα*-308G>A, LTA*+252A>G, IL1B*-511C>T, IL1B*+3953C>Т, IL1RN*VNTR в группах новорожденных с дыхательными расстройствами и в контроле не различалось (табл. 1).
Таблица 1
Распределение частот редких аллелей генов цитокинов TNFα, LTA, IL1B, IL1RN в группах больных с ДР и в контрольной группе
|
Редкие аллели |
TNFα* -308A |
LTA* +252G |
IL1B* -511T |
IL1B* +3953T |
IL1RN* А2 |
IL1RN* А3 |
|
Группы |
|
n / % |
n / % |
n / % |
n / % |
n / % |
n / % |
|
Контроль |
28 / 13,46 |
59 / 28,64 |
69 / 33,50 |
46 / 22,12 |
42 / 20,19 |
4 / 1,92 |
||
Больные с ДР |
31 / 14,35 |
56 / 25,93 |
76 / 33,50 |
51 / 24,06 |
50 / 23,15 |
5 / 2,31 |
||
χ² p |
0,016 0,902 |
0,268 0,605 |
0,111 0,740 |
0,127 0,722 |
0,385 0,535 |
0,01 1,001 |
||
РДС |
22 / 15,49 |
39 / 27,46 |
48 / 34,29 |
34 / 24,64 |
35 / 24,65 |
4 / 2,82 |
||
χ² p |
0,143 0,706 |
0,015 0,907 |
0,002 0,971 |
0,172 0,678 |
0,734 0,392 |
0,035 0,854 |
||
ВП |
9 / 12,16 |
17 / 22,97 |
28 / 37,84 |
17 / 22,97 |
15 / 20,27 |
1 / 1,35 |
||
χ² p |
0,008 0,934 |
0,622 0,431 |
0,782 0,595 |
0,001 1,001 |
0,001 1,001 |
0,001 1,001 |
Анализ взаимосвязи полиморфизма генов цитокинов с развитием инфекционных осложнений в виде пневмонии у больных РДС выявил значимые различия в частотах генотипов и аллелей только для локусов TNFα*-308G>A и IL1RN*VNTR (табл. 2). Так, гомозиготный генотип АА полиморфного локуса TNFα*-308G>A ни разу не был отмечен в подгруппе РДС с ВП, а в подгруппе с РДС без ВП обнаружен в 12,5% случаев (p=0,035). Таким образом, для носителей генотипа АА риск развития инфекционных осложнений у новорожденных с РДС снижен (OR=0,06, 95% CI 0,0033-0,55).
С существенно более высокой частотой в подгруппе РДС без ВП встречался аллель *А2 гена IL1RN по сравнению с подгруппой РДС с ВП (p=0,014) (табл. 2). Напротив, аллель *А1 оказался более редким в той же подгруппе (p=0,0028), так же как генотип А1А1 (p=0,023). Таким образом, маркером предрасположенности к развитию инфекционных осложнений у больных РДС можно считать аллельный вариант *А1 гена IL1RN (OR=3,28, 95% CI 1,43-7,61) и генотип А1А1 (OR=3,53, 95% CI 1,12-11,41). Маркером же устойчивости является аллель *А2 (OR=0,37, 95% CI 0,16-0,87).
Таблица 2
Распределение частот генотипов и аллелей полиморфных локусов генов TNFα и IL1RN у больных РДС в зависимости от наличия осложнения ВП
Генотипы и аллели |
РДС без ВП |
РДС с ВП |
p |
n / % |
n / % |
||
-308G>A TNFα |
|||
N |
24 |
47 |
|
GG |
17 / 70,83 |
35 / 74,47 |
0,961 |
GA |
4 /16,67 |
12 / 25,53 |
0,580 |
AA |
3 / 12,50 |
0 / 0 |
0,035 |
G |
38 / 79,17 |
82 / 87,23 |
0,313 |
A |
10 / 20,83 |
12 / 12,77 |
|
VNTR 86 п.о. IL1RN |
|||
N |
24 |
47 |
|
A1A1 |
8 / 33,33 |
30 / 63,83 |
0,023 |
A1A2 |
11 / 45,83 |
15 / 31,91 |
0,368 |
A1A3 |
0 / 0 |
1 / 2,13 |
1,000 |
A2A2 |
3 / 12,50 |
1 / 2,13 |
0,206 |
A2A3 |
1 / 4,17 |
0 / 0 |
0,724 |
A3A3 |
1 / 4,17 |
0 / 0 |
0,724 |
A1 |
27 / 56,25 |
76 / 80,85 |
0,0028 |
A2 |
18 / 37,50 |
17 / 18,09 |
0,014 |
A3 |
3 / 6,25 |
1 / 1,06 |
0,213 |
Поскольку гены TNFα и LTA, а также IL1B и IL1RN попарно сцеплены, нами проведен сравнительный гаплотипический анализ у больных с ДР, РДС, ВП и в контроле (табл. 3).
Таблица 3
Частоты гаплотипов локусов TNFα*-308G>A- LTA*252A>G и IL1B*-511C>T - IL1B*3953C>Т - IL1RN*A1>*A2 у больных с ДР, в подгруппах разного течения РДС, ВП и контроле
Гаплотипы |
Больные с ДР |
РДС |
ВП |
Контроль |
РДС без ВП |
РДС с ВП |
n / % |
n / % |
n / % |
n / % |
n / % |
n / % |
|
N |
216 |
142 |
74 |
206 |
48 |
94 |
TNFα*-308G>A - LTA*252A>G |
||||||
G - A |
157/ 72,69 |
100 / 70,42 |
57 / 77,03 |
143 / 69,42 |
33 / 68,75 |
67 / 71,28 |
G - G |
29 / 13,43 |
20 / 14,08 |
8 / 10,81 |
35 / 16,99 |
5 /10,42 |
15 / 15,96 |
A -A |
3 / 1,39 |
3 / 2,11 |
0 |
4 / 1,94 |
3 / 6,25 |
0 |
A -G |
27 / 12,50 |
19 / 13,38 |
9 / 12,16 |
24 / 11,65 |
7 / 14,58 |
12 / 12,77 |
IL1B*-511C>T - IL1B*3953C>Т - IL1RN *A1>*A2 |
||||||
N |
204 |
132 |
72 |
198 |
40 |
92 |
C-C-*A1 |
77 / 37,75 |
52 / 39,39 |
25 / 34,72 |
94 / 47,47 |
13 / 32,50 |
38 / 41,30 |
C-C-*A2 |
12 / 5,88 |
7 /5,30 |
5 / 6,94 |
4 / 2,02 |
2 / 5,00 |
6 / 6,52 |
C-T-*A1 |
34 / 16,67 |
22 / 16,67 |
12 16,67 |
25 / 12,63 |
4 / 10,00 |
18 / 19,57 |
C-T-*A2 |
7 / 3,43 |
5 / 3,79 |
2 / 2,78 |
6 / 3,03 |
5 / 12,50 |
0 |
T-C-*A1 |
43 / 21,08 |
27 /20,45 |
16 / 22,22 |
29 /14,65 |
8 /20,00 |
19 / 20,65 |
T-C-*A2 |
23 / 11,27 |
14 / 10,61 |
9 / 12,50 |
30 / 15,15 |
7 / 17,50 |
7 / 7,61 |
T-T-*A1 |
3 / 1,47 |
0 |
3 / 4,17 |
10 /5,05 |
0 |
0 |
T-T-*A2 |
5 / 2,45 |
5 / 3,79 |
0 |
0 |
1 / 2,50 |
4 / 4,35 |
Статистически значимых различий между всеми группами больных и контролем по частотам гаплотипов полиморфных локусов TNFα*-308G>A -LTA*252A>G выявлено не было (p=0,99, p=1,00, p=0,48 соответственно).
Сравнительный анализ встречаемости гаплотипов в подгруппах новорожденных с РДС выявил увеличение доли гаплотипа G-G в подгруппе с РДС с ВП и отсутствие в той же подгруппе носителей гаплотипа А-А (χ²=3,36, p=0,037) (табл. 3). Следовательно, гаплотип А-А является маркером устойчивости к развитию ВП у больных РДС новорожденных (OR=0,069, 95% CI 0,0035-0,57).
Распределение частот гаплотипов полиморфных локусов IL1B*-511C>T, IL1B*3953C>Т, IL1RN*A1>*A2 в группе больных с ДР существенно отличалось от такового в контроле (χ²=18,68, p<0,001). Однако по частотам отдельных гаплотипов наблюдаемые различия не достигли уровня статистической значимости (табл. 3). В то же время группа больных с РДС значимо отличалась от контроля (χ²=21,74, p<0,001) (табл. 3), это было обусловлено повышением доли гаплотипа T-Т-*A2 (p=0,0098) и снижением доли гаплотипа T-Т-*A1 в группе с РДС до 0% против 5,05 % в контроле (p=0,0079).
Следовательно, аллель *А2 гена IL1RN является маркером предрасположенности к возникновению РДС, но только в сочетании с двумя аллелями Т локусов -511C>T и 3953C>Т гена IL1B (OR=17,13, 95% CI 2,28-361,60). Аллель *А1 в свою очередь в сочетании с теми же аллелями гена IL1B связан со сниженным риском развития РДС и является маркером устойчивости (OR=0,068, 95% CI 0,038-0,47).
Общее распределение частот гаплотипических вариантов между подгруппами РДС с пневмонией и без нее значительно различалось: χ²=16.53, p=0.002 (табл. 3). Показано, существенное уменьшение доли гаплотипа С-Т-*А2 (χ²=8,77, p=0,004) в подгруппе РДС с ВП (0%) по сравнению с 12,50% в подгруппе РДС без ВП. Гаплотип IL1B*-511С-IL1B*3953T-IL1RN*А2 может рассматриваться в качестве маркера устойчивости к развитию инфекционных осложнений у больных РДС (OR=0,035, 95% CI 0,0021-0,27).
Обсуждение
Проведенное нами исследование роли полиморфных локусов TNFα*-308G>A, LTA*+252A>G, IL1B*-511C>T, IL1B*+3953C>Т, IL1RN*А1>*А2 в развитии наследственной предрасположенности к дыхательным расстройствам показало, что гаплотип IL1B*-511T-IL1B*3953Т-IL1RN*A2 ассоциирован с повышенным риском развития РДС (OR=17,13, 95% CI 2,28-361,60), а гаплотип IL1B*-511T-IL1B*3953Т-IL1RN*A1 - со сниженным риском (OR=0,068, 95% CI 0,038-0,47). Кроме того, обнаружены маркеры предрасположенности к развитию инфекционных осложнений (ВП) у больных РДС: аллель *А1 и генотип А1А1 VNTR локуса гена IL1RN (OR=3,28, 95% CI 1,43-7,61 и OR=3,53, 95% CI 1,12-11,41 соответственно). Аллель IL1RN *А2 (OR=0,37, 95% CI 0,16-0,87); генотип АА полиморфного сайта TNFα*-308G>A; гаплотипы TNFα*-308A-LTA*252A (OR=0.069, 95% CI 0,003-0,57) и IL1B*-511С-IL1B*3953T-IL1RN*А2 (OR=0,035, 95% CI 0,0021-0,27), напротив, ассоциированы со снижением риска развития ВП у больных РДС новорожденных.
В доступных источниках практически отсутствуют исследования, посвященные исследованию полиморфных локусов генов цитокинов у новорожденных с РДС и ВП. Однако в работе Capasso M. с соавторами в итальянской популяции не было выявлено взаимосвязи полиморфизма TNFα*-308G>A с развитием РДС у недоношенных новорожденных. Еще в одном исследовании показана связь комбинации генотипов по генам TNFα и IL6 с повышенным риском острого повреждения почек у детей с инфекцией [10]. Кроме того, вопрос о функциональной значимости полиморфизма генов TNFα и LTA остается открытым. Вследствие этого трудно дать оценку значения показанных нами ассоциаций генотипа АА гена TNFα и гаплотипа А-А генов TNFα и LTA с устойчивостью к развитию инфекционных осложнений у больных РДС. Кроме того, гены TNFα и LTA расположены между кластерами генов комплекса гистосовместимости (HLA) I и III класса. Вероятно, аллели генов TNFα и LTA находятся в неравновесном сцеплении с некоторыми аллелями генов HLA (около 200 генов), влияющими на развитие аутоиммунных и воспалительных реакций.
По данным Patwari P. с соавторами, в исследовании детей с внебольничной пневмонией отсутствие аллеля *А1 гена IL1RN оказалось ассоциировано с повышенным риском более тяжелого течения, необходимостью в искусственной вентиляции легких, развитием острого повреждения легких или острого РДС. В нашей работе тот же аллель оказался ассоциирован с развитием РДС новорожденных в составе гаплотипа с 2 полиморфными сайтами гена IL1B [9]. В то же время в корейской популяции не было выявлено ассоциации полиморфного сайта IL1B*-511C>T с развитием бронхолегочной дисплазии - осложнения лечения РДС у недоношенных детей повышенными концентрациями кислорода [7]. Вопрос о функциональной значимости полимофизмов генов семейства IL1 также остается дискуссионным [9]. В связи с этим объяснение механизмов влияния полиморфных вариантов генов цитокинов TNFa, LTA, IL1B, IL1RN на развитие самого РДС и его осложнений пневмонией требует проведения дальнейших исследований.
Заключение
Нами показано, что генетические варианты цитокинов TNFa, LTA, IL1B, IL1RN могут занимать определенную место не только в развитии вариантов течения респираторного дистресс-синдрома у новорожденных, но и играть важную роль в предрасположенности к формированию РДС. Однако для подтверждения полученных нами результатов и оценки возможного влияния других факторов на формирование и степень тяжести РДС необходимы увеличение выборки и проверка полученных результатов на независимой выборке.
Рецензенты:
Хисамов Э.Н., д.б.н., профессор кафедры патологической физиологии, ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России, г. Уфа;
Корытина Г.Ф., д.б.н., доцент, старший научный сотрудник лаборатории физиологической генетики ФГБУН Институт биохимии и генетики УНЦ РАН, г. Уфа.
Библиографическая ссылка
Данилко К.В., Богданова Р.З., Фатыхова А.И., Куватова Д.Н., Исхакова Г.М., Викторова Т.В., Викторова Т.В. ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ У ДЕТЕЙ С ДЫХАТЕЛЬНЫМИ РАССТРОЙСТВАМИ // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 6. ;URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=22928 (дата обращения: 13.02.2025).