Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,813

CYTOKINE GENE POLYMORPHISM IN CHILDREN WITH RESPIRATORY DISORDERS

Danilko K.V. 1 Bogdanova R.Z. 2 Fatykhova A.I. 3 Kuvatova D.N. 1 Iskhakova G.M. 1 Viktorova T.V. 1, 4
1 Bashkir State Medical University
2 Republican Clinical Hospital n.a. G.G. Kuvatova
3 Ufa City Clinical Hospital №17
4 Institute of Biochemistry and Genetics RAS
Проведена оценка роли полиморфных вариантов генов цитокинов TNF, LTA, IL1B, IL1RN в развитии наследственной предрасположенности к дыхательным расстройствам у новорожденных. Образцы ДНК 108 новорожденных с дыхательными расстройствами (респираторным дистресс-синдромом (РДС) и врожденной пневмонией (ВП)) и 104 здоровых новорожденных использовались для генотипирования методами ПЦР и рестрикционного анализа по полиморфным локусам TNFα*-308G>A, LTA*+252A>G, IL1B*-511C>T, IL1B*+3953C>Т, IL1RN*VNTR. Установлено, что предрасположенность к развитию РДС маркирует гаплотип IL1B*-511T-IL1B*3953Т-IL1RN*A2 (OR=17.13). Маркером устойчивости к развитию РДС является гаплотип IL1B*-511T-IL1B*3953Т-IL1RN*A1 (OR=0.068). Предрасположенность к инфекционным осложнениям РДС маркирует аллель *А1 (OR=3.38) и генотип А1А1 минисателлитного локуса гена IL1RN (OR=3.53). Маркерами устойчивости к возникновению инфекционных осложнений РДС являются генотип АА локуса TNFα*-308G>A (OR=0.06), а также гаплотип TNFα*-308A-LTA*252A (OR=0.069), аллель *А2 минисателлитного локуса гена IL1RN (OR=0.37) и гаплотип IL1B*-511С-IL1B*3953T-IL1RN*А2 (OR=0.035). Установлено, что полиморфные варианты генов цитокинов TNFα, IL1B, IL1RN, являются важными генетическими компонентами мультифакториальной структуры РДС и ВП новорожденных.
We have done the evaluation of the role of cytokine genes TNF, LTA, IL1B, IL1RN polymorphic variants in the development of hereditary predisposition to respiratory failure in infants. 108 DNA samples of infants with respiratory disorders (respiratory distress syndrome (RDS) and congenital pneumonia (CP)) and 104 healthy newborns DNA sample were used for genotyping by PCR and restriction analysis of polymorphic loci TNFα* -308G>A, LTA*+252A>G, IL1B*-511C>T, IL1B*+3953C>T, IL1RN*VNTR. Predisposition to the development of RDS marks haplotype IL1B*-511T-IL1B*3953Т-IL1RN*A2 (OR=17.13). Protective markers of RDS haplotype are IL1B*-511T-IL1B*+3953T-IL1RN*A1 (OR=0.068). Susceptibility to infectious complications of RDS marks *A1 allele (OR=3.38) and A1A1 genotype of minisatellite gene locus IL1RN (OR=3.53). Protective marker of RDS infectious complications are genotype AA of TNFα-308G>A polymorphism (OR=0.06), as well as TNFα*-308A-LTA*252A haplotype (OR=0.069), *A2 allele of IL1RN minisatellite locus (OR=0.37) and the IL1B*-511С-IL1B*3953T-IL1RN*А2 haplotype (OR=0.035). The polymorphic variants of cytokine genes TNFα, IL1B, IL1RN were found to be important components of multifactorial genetic structure of RDS and CP in newborns.
respiratory distress syndrome
congenital pneumonia
gene polymorphism
cytokines
Несмотря на значительные достижения неонатологии последних десятилетий, проблема дыхательных расстройств по-прежнему актуальна. Среди всех дыхательных нарушений новорожденных одно из ведущих мест принадлежит респираторному дистресс-синдрому (РДС) и врожденной пневмонии (ВП). Хотя терминология в отечественной и зарубежной литературе не совпадает, считается, что РДС встречается повсеместно у 1-2% всех живорожденных и у 14% детей, родившихся с массой тела менее 2500 г. Частота развития РДС обратно пропорциональна степени недонашивания беременности [3].

В основе РДС лежит нарушение функции сурфактанта, что может быть связано с дефицитом или дефектом его продукции, инактивацией или усилением деградации. Вторичный дефицит сурфактанта наблюдается и в случае развития ВП. Нарушение состава и количества сурфактанта связано со снижением его защитной функции и возникновением воспаления [2]. Пневмонию диагностируют примерно у 0,5-1% доношенных и 10-15% недоношенных новорожденных. По данным литературы, пневмонию на секции выявляют у 15-38% мертворожденных и 20-32% умерших живорожденных детей [3].

В патогенезе расстройств дыхания чрезвычайно важна роль иммунной системы в ранней постнатальной адаптации, а клиническое состояние ребенка в этот период может быть обусловлено нарушением баланса про- и противовоспалительных цитокинов. Защита на местном уровне развивается путем формирования типичной воспалительной реакции в ответ на повреждение и проникновение в ткани патогенов при участии интерлейкинов (IL) 1, 6, 8, фактора некроза опухоли a (TNFa), лимфотоксина альфа (LTA) и др. [1].

Известно, что интенсивность синтеза цитокинов обусловлена генетически. На сегодняшний день описан полиморфизм генов многих цитокинов [13]. Показано, что варианты генов цитокинов ассоциированы с восприимчивостью к аутоиммунным, аллергическим и инфекционным заболеваниям, особенностями и тяжестью их течения, а также с повышенным или, напротив, пониженным содержанием продуцируемых цитокинов [11].

Гены TNFα и LTA, кодирующие соответствующие цитокины TNFa и LTA, сцеплены на хромосоме 6. На линиях В-клеток человека было показано, что полиморфизм -308G>A ассоциирован с повышенной экспрессией гена TNFα in vitro: присутствие аллеля А связано с вдвое повышенной продукцией цитокина по сравнению с аллелем G [13].

В исследовании Messer G. с соавторами была выявлена ассоциация аллеля G полиморфизма +252G>А гена LTA с повышенным уровнем экспрессии LTA в периферических моноцитах крови в результате повышения уровня транскрипции гена [8]. Этот полиморфизм недостаточно изучен при различных заболеваниях легких.

Гены IL1B и IL1RN картированы на длинном плече хромосомы 2 в области 2q14. Для промоторной области гена IL1B описана замена С на T -511 положении. Кроме того, известен полиморфизм IL1B*3539С>T в 5 экзоне, причем его аллель T ассоциирован с более высокой продукцией цитокина [6].

Для гена IL1RN описан минисателлитный полиморфизм во 2-м интроне - вариабельность по числу 86-членных тандемных повторов. Hurme et al. (1998) было показано, что аллель IL1RN*A2 коррелирует с более высоким уровнем рецепторного анатогониста IL1 в плазме, но только в комбинации с аллелем -511T гена IL1B [6].

Цель исследования

Оценить роль полиморфных вариантов генов цитокинов TNFa, LTA, IL1B, IL1RN в развитии наследственной предрасположенности к дыхательным расстройствам у новорожденных.

Материал и методы

Для проведения исследования было получено 108 образцов периферической крови новорожденных детей с дыхательными расстройствами (ДР), собранной во время рутинных манипуляций. Все пациенты находились на лечении в отделении реанимации и интенсивной терапии новорожденных Городской Клинической больницы № 17 г. Уфы. Диагноз устанавливался врачами-неонатологами на основании клинических и рентгенологических данных. Пациентов с РДС оказалось 24 человека, с ВП - 37 и с РДС, осложненным пневмонией, - 47. Среди больных - 62,04% мальчиков и 37,96% девочек. Средний вес младенцев составил 2295±845 г. Средний гестационный возраст больных составил 34,14±3,83 (28-42) недели. В группу сравнения вошли 104 здоровых ребенка первых суток жизни, родившихся в Родильном доме № 8 г. Уфы. Мальчиков в этой группе оказалось 42,3%, девочек - 57,7%. Вес новорожденных составил в среднем 3518±404 г, средний гестационный возраст - 39,18±1,03 недели. Образцы крови  здоровых новорожденных были получены из пуповины немедленно после рождения. Взятие образцов крови проводилось с информированного согласия родителей. ДНК выделяли из лейкоцитов микрометодом фенольно-хлороформной экстракции. Исследование полиморфных локусов TNFα*-308G>A, LTA*+252A>G, IL1B*-511C>T, IL1B*+3953C>Т, IL1RN*VNTR проводили методами ПЦР и/или рестрикционного анализа согласно ранее описанным методикам [4, 5, 12]. Частоты генотипов или аллелей вычисляли в Microsoft Excel. Частоты гаплотипов рассчитывали в программе «The EH software program». Ассоциацию аллелей генотипов и гаплотипов с развитием заболевания выявляли с использованием критерия χ2 с поправкой Йетса. Точный двухсторонний тест Фишера использовали в случае суммарного количества индивидов в группах менее 100. Для расчетов использовали программу STATISTICA v.6.0. Статистически значимыми считали различия при p<0,05. Соответствие распределения частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга (χ2) определяли по стандартным формулам при помощи программы BIOSIS-2. Силу ассоциаций маркеров с риском развития ДР оценивали по значениям показателя отношения шансов (OR) и его 95%CI по стандартной формуле в Microsoft Excel.

Результаты

Ни в одной из сравниваемых групп не было выявлено отклонений от равновесия Харди-Вайнберга по частотам генотипов всех изученных локусов. Распределение частот аллелей полиморфных локусов TNFα*-308G>A, LTA*+252A>G, IL1B*-511C>T, IL1B*+3953C>Т, IL1RN*VNTR в группах новорожденных с дыхательными расстройствами и в контроле не различалось (табл. 1).

Таблица 1

Распределение частот редких аллелей генов цитокинов TNFα, LTA,  IL1B,  IL1RN в группах больных с ДР и в контрольной группе

 

Редкие аллели

TNFα*

-308A

LTA*

+252G

IL1B*

-511T

IL1B*

+3953T

IL1RN*

А2

IL1RN*

А3

Группы

 

n / %

n / %

n / %

n / %

n / %

n / %

Контроль

28 / 13,46

59 / 28,64

69 / 33,50

46 / 22,12

42 / 20,19

4 / 1,92

Больные с ДР

31 / 14,35

56 / 25,93

76 / 33,50

51 / 24,06

50 / 23,15

5 / 2,31

χ²

p

0,016

0,902

0,268

0,605

0,111

0,740

0,127

0,722

0,385

0,535

0,01

1,001

РДС

22 / 15,49

39 / 27,46 

48 / 34,29

34 / 24,64

35 / 24,65

4 / 2,82

χ²

p

0,143

0,706

0,015

0,907

0,002

0,971

0,172

0,678

0,734

0,392

0,035

0,854

ВП

9 / 12,16

17 / 22,97

28 / 37,84

17 / 22,97

15 / 20,27

1 / 1,35

χ²

p

0,008

0,934

0,622

0,431

0,782

0,595

0,001

1,001

0,001

1,001

0,001

1,001

Анализ взаимосвязи полиморфизма генов цитокинов с развитием инфекционных осложнений в виде пневмонии у больных РДС выявил значимые различия в частотах генотипов и аллелей только для локусов TNFα*-308G>A и IL1RN*VNTR (табл. 2). Так, гомозиготный генотип АА полиморфного локуса TNFα*-308G>A ни разу не был отмечен в подгруппе РДС с ВП, а в подгруппе с РДС без ВП обнаружен в 12,5% случаев (p=0,035). Таким образом, для носителей генотипа АА риск развития инфекционных осложнений у новорожденных с РДС снижен (OR=0,06, 95% CI 0,0033-0,55).

С существенно более высокой частотой в подгруппе РДС без ВП встречался аллель *А2 гена IL1RN по сравнению с подгруппой РДС с ВП (p=0,014) (табл. 2). Напротив, аллель *А1 оказался более редким в той же подгруппе (p=0,0028), так же как генотип А1А1 (p=0,023). Таким образом, маркером предрасположенности к развитию инфекционных осложнений  у больных РДС можно считать аллельный вариант *А1 гена IL1RN (OR=3,28, 95% CI 1,43-7,61) и генотип А1А1 (OR=3,53, 95% CI 1,12-11,41). Маркером же устойчивости является аллель *А2 (OR=0,37, 95% CI 0,16-0,87).

Таблица 2

Распределение частот генотипов и аллелей полиморфных локусов генов TNFα и IL1RN у больных РДС в зависимости от наличия осложнения ВП

Генотипы

и аллели

РДС без ВП

РДС с ВП

p

n / %

n / %

-308G>A TNFα

N

24

47

 

GG

17 / 70,83

35 / 74,47

0,961

GA

4 /16,67

12 / 25,53

0,580

AA

3 / 12,50

0 / 0

0,035

G

38 / 79,17

82 / 87,23

0,313

A

10 / 20,83

12 / 12,77

VNTR 86 п.о. IL1RN

N

24

47

 

A1A1

8 / 33,33

30 / 63,83

0,023

A1A2

11 / 45,83

15 / 31,91

0,368

A1A3

0 / 0

1 / 2,13

1,000

A2A2

3 / 12,50

1 / 2,13

0,206

A2A3

1 / 4,17

0 / 0

0,724

A3A3

1 / 4,17

0 / 0

0,724

A1

27 / 56,25

76 / 80,85

0,0028

A2

18 / 37,50

17 / 18,09

0,014

A3

3 / 6,25

1 / 1,06

0,213

Поскольку гены TNFα и LTA, а также IL1B и IL1RN попарно сцеплены, нами проведен сравнительный гаплотипический анализ у больных с ДР, РДС, ВП и в контроле (табл. 3).

Таблица 3

Частоты гаплотипов локусов TNFα*-308G>A- LTA*252A>G и IL1B*-511C>T - IL1B*3953C>Т - IL1RN*A1>*A2 у больных с ДР, в подгруппах разного течения РДС, ВП  и контроле

Гаплотипы

Больные с ДР

РДС

ВП

Контроль

РДС без ВП

РДС с ВП

n / %

n / %

n / %

n / %

n / %

n / %

N

216

142

74

206

48

94

TNFα*-308G>A - LTA*252A>G

G - A

157/ 72,69

100 / 70,42

57 / 77,03

143 / 69,42

33 / 68,75

67 / 71,28

G - G

29 / 13,43

20 / 14,08

8 / 10,81

35 / 16,99

5 /10,42

15 / 15,96

A -A

3 / 1,39

3 / 2,11

0

4 / 1,94

3 / 6,25

0

A -G

27 / 12,50

19 / 13,38

9 / 12,16

24 / 11,65

7 / 14,58

12 / 12,77

IL1B*-511C>T - IL1B*3953C>Т - IL1RN *A1>*A2

N

204

132

72

198

40

92

C-C-*A1

77 / 37,75

52 / 39,39

25 / 34,72

94 / 47,47

13 / 32,50

38 / 41,30

C-C-*A2

12 / 5,88

7 /5,30

5 / 6,94

4 / 2,02

2 / 5,00

6 / 6,52

C-T-*A1

34 / 16,67

22 / 16,67

12  16,67

25 / 12,63

4 / 10,00

18 / 19,57

C-T-*A2

7 / 3,43

5 / 3,79

2 / 2,78

6 / 3,03

5 / 12,50

0

T-C-*A1

43 / 21,08

27 /20,45

16 / 22,22

29 /14,65

8 /20,00

19 / 20,65

T-C-*A2

23 / 11,27

14 / 10,61

9 / 12,50

30 / 15,15

7 / 17,50

7 / 7,61

T-T-*A1

3 / 1,47

0

3 / 4,17

10 /5,05

0

0

T-T-*A2

5 / 2,45

5 / 3,79

0

0

1 / 2,50

4 / 4,35

Статистически значимых различий между всеми группами больных и контролем по частотам гаплотипов полиморфных локусов TNFα*-308G>A -LTA*252A>G выявлено не было (p=0,99, p=1,00, p=0,48 соответственно).

Сравнительный анализ встречаемости гаплотипов в подгруппах новорожденных с РДС выявил увеличение доли гаплотипа G-G в подгруппе с РДС с ВП и отсутствие в той же подгруппе носителей гаплотипа А-А (χ²=3,36, p=0,037) (табл. 3). Следовательно, гаплотип А-А является маркером устойчивости к развитию ВП у больных РДС новорожденных (OR=0,069, 95% CI 0,0035-0,57).

Распределение частот гаплотипов полиморфных локусов IL1B*-511C>T, IL1B*3953C>Т, IL1RN*A1>*A2 в группе больных с ДР существенно отличалось от такового в контроле (χ²=18,68, p<0,001). Однако по частотам отдельных гаплотипов наблюдаемые различия не достигли уровня статистической значимости (табл. 3). В то же время группа больных с РДС значимо отличалась от контроля (χ²=21,74, p<0,001) (табл. 3), это было обусловлено повышением доли гаплотипа T-Т-*A2 (p=0,0098) и снижением доли гаплотипа T-Т-*A1 в группе с РДС до 0% против 5,05 %  в контроле (p=0,0079).

Следовательно, аллель *А2 гена IL1RN является маркером предрасположенности к  возникновению РДС, но только в сочетании с двумя аллелями Т локусов -511C>T и 3953C>Т гена  IL1B (OR=17,13, 95% CI 2,28-361,60). Аллель *А1 в свою очередь в сочетании с теми же аллелями гена IL1B связан со сниженным риском развития РДС и является маркером устойчивости (OR=0,068, 95% CI 0,038-0,47).

Общее распределение частот гаплотипических вариантов между подгруппами РДС с пневмонией и без нее значительно различалось: χ²=16.53, p=0.002 (табл. 3). Показано, существенное уменьшение доли гаплотипа С-Т-*А2 (χ²=8,77, p=0,004) в подгруппе РДС с ВП (0%) по сравнению с 12,50% в подгруппе РДС без ВП. Гаплотип IL1B*-511С-IL1B*3953T-IL1RN*А2 может рассматриваться в качестве маркера устойчивости к развитию инфекционных осложнений у больных РДС (OR=0,035, 95% CI 0,0021-0,27).

Обсуждение

Проведенное нами исследование роли полиморфных локусов TNFα*-308G>A, LTA*+252A>G, IL1B*-511C>T, IL1B*+3953C>Т, IL1RN*А1>*А2 в развитии наследственной предрасположенности к дыхательным расстройствам показало, что гаплотип IL1B*-511T-IL1B*3953Т-IL1RN*A2 ассоциирован с повышенным риском развития РДС (OR=17,13, 95% CI 2,28-361,60), а гаплотип IL1B*-511T-IL1B*3953Т-IL1RN*A1 - со сниженным риском (OR=0,068, 95% CI 0,038-0,47). Кроме того, обнаружены маркеры предрасположенности к развитию инфекционных осложнений (ВП) у больных РДС: аллель *А1 и генотип А1А1 VNTR локуса гена IL1RN (OR=3,28, 95% CI 1,43-7,61 и OR=3,53, 95% CI 1,12-11,41 соответственно). Аллель IL1RN *А2 (OR=0,37, 95% CI 0,16-0,87); генотип АА полиморфного сайта TNFα*-308G>A; гаплотипы TNFα*-308A-LTA*252A (OR=0.069, 95% CI 0,003-0,57) и IL1B*-511С-IL1B*3953T-IL1RN*А2 (OR=0,035, 95% CI 0,0021-0,27), напротив, ассоциированы со снижением риска развития ВП у больных РДС новорожденных.

В доступных источниках практически отсутствуют исследования, посвященные исследованию полиморфных локусов генов цитокинов у новорожденных с РДС и ВП. Однако в работе Capasso M. с соавторами в итальянской популяции не было выявлено взаимосвязи полиморфизма TNFα*-308G>A с развитием РДС у недоношенных новорожденных. Еще в одном исследовании показана связь комбинации генотипов по генам  TNFα и IL6 с повышенным риском острого повреждения  почек у детей с инфекцией [10]. Кроме того, вопрос о функциональной значимости полиморфизма генов TNFα и LTA остается открытым. Вследствие этого трудно дать оценку значения показанных нами ассоциаций генотипа АА гена TNFα и гаплотипа А-А  генов TNFα и LTA с устойчивостью к развитию инфекционных осложнений у больных РДС. Кроме того, гены TNFα и LTA расположены между кластерами генов комплекса гистосовместимости (HLA) I и III класса. Вероятно, аллели генов TNFα и LTA находятся в неравновесном сцеплении с некоторыми аллелями генов HLA (около 200 генов), влияющими на развитие аутоиммунных и воспалительных реакций.

По данным Patwari P. с соавторами, в исследовании детей с внебольничной пневмонией отсутствие аллеля *А1 гена IL1RN оказалось ассоциировано с повышенным риском более тяжелого течения, необходимостью в искусственной вентиляции легких, развитием острого повреждения легких или острого РДС. В нашей работе тот же аллель оказался ассоциирован с развитием РДС новорожденных в составе гаплотипа с 2 полиморфными сайтами гена IL1B [9]. В то же время в корейской популяции не было выявлено ассоциации полиморфного сайта IL1B*-511C>T с развитием бронхолегочной дисплазии - осложнения лечения РДС у недоношенных детей повышенными концентрациями кислорода [7]. Вопрос о функциональной значимости полимофизмов генов семейства IL1 также остается дискуссионным [9]. В связи с этим объяснение механизмов влияния полиморфных вариантов генов цитокинов TNFa, LTA, IL1B, IL1RN на развитие самого РДС и его осложнений пневмонией требует проведения дальнейших исследований.

Заключение

Нами показано, что генетические варианты цитокинов TNFa, LTA, IL1B, IL1RN могут занимать определенную место не только в  развитии вариантов течения респираторного дистресс-синдрома у новорожденных, но и играть важную роль в предрасположенности к формированию РДС. Однако для подтверждения полученных нами результатов и оценки возможного влияния других факторов на формирование и степень тяжести РДС необходимы увеличение выборки и проверка полученных результатов на независимой выборке.

Рецензенты:

Хисамов Э.Н., д.б.н., профессор кафедры патологической физиологии, ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России, г. Уфа;

Корытина Г.Ф., д.б.н., доцент, старший научный сотрудник лаборатории физиологической генетики ФГБУН Институт биохимии и генетики УНЦ РАН, г. Уфа.