Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

БИОТЕСТИРОВАНИЕ СЫВОРОТКИ КРОВИ С ЦЕЛЬЮ ОЦЕНКИ ТЕЧЕНИЯ РЕПАРАТИВНОГО ПРОЦЕССА У ПАЦИЕНТОВ С АХОНДРОПЛАЗИЕЙ

Ковинька М.А. 1
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» имени академика Г.А. Илизарова» Минздрава РФ
В работе предложен способ оценки течения репаративного процесса у пациентов с ахондроплазией, находящихся на этапах лечения методиками чрескостного дистракционного остеосинтеза. Принцип способа основывается на способности сыворотки крови, активированной остеогенезом, воздействовать на процессы кроветворения. В ходе исследования сыворотку крови пациентов с ахондроплазией отбирали на различных сроках лечения методом чрескостного остеосинтеза, модифицировали по оригинальной методике и вводили лабораторным мышам. В периферической крови мышей оценивали количество ретикулоцитов и моноцитов до введения модифицированной сыворотки крови и через 48 часов после введения. Установлено, что наибольшие изменения в периферической крови мышей наступают после введения модифицированной сыворотки, взятой на 3 и 4 неделе дистракции. Обсуждается возможность использования данного способа с целью оценки течения репаративного процесса у пациентов ортопедического профиля.
моноциты
ретикулоциты
ахондроплазия
сыворотка крови
Биотестирование
1. Гребнева О.Л. Ускорение минерализации дистракционного регенерата с помощью компонентов плазмы крови / О.Л. Гребнева, М.А. Ковинька, А.М. Аранович, Е.В. Осипова // Гений ортопедии. – 2010. – № 2. – С. 11–14.
2. Десятниченко К.С. Влияние белковых рострегулирующих факторов внеклеточно¬го матрикса костной ткани на репаративный остеогенез и кроветво¬рение / К.С. Десятниченко, Ю.П. Балдин, А.Н. Дьячков // Цитология. – 1989. – Т.31. – № 9. – С.92.
3. Дудин М.Г. Биотестирование сыворотки крови как метод диагностики типа идиопатического сколиоза у детей / М.Г. Дудин, Т.В. Авалиани, Д.Ю. Пинчук // Клиническая патофизиология. – 2006. – №1. – С. 12-19.
4. Назаренко, Г. И. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований / Г. И. Назаренко, А. А. Кишкун. – М.: Медицина, 2002. – 544 с.
5. Оценка течения репаративногоостеогенеза: Метод. рекомендации / РНЦ «ВТО» им. Г.А.Илизарова; Сост.: Ю.П. Балдин, К.С. Десятниченко. – Курган, 1991. – 23с.
6. Щукин А.А. Оценка результатов удлинения нижних конечностей у больных с системными заболеваниями скелета, сопровождающимися патологически низким ростом / А.А. Щукин, А.М. Аранович, А.В. Попков, Д.А. Попков // Гений Ортопедии. – 2014. – № 2. – C. 44–50.
7. Ястребов А.П., Осипенко А.В. Система крови и регенерация костной ткани. – Свердловск: Изд-во Уральского ун-та, 1990. – 124 с.

Ахондроплазия – системное поражение скелета, в основе которого лежат генетические изменения, приводящие к нарушениям энхондрального роста длинных и коротких трубчатых костей. Заболевание относится к группе физарных дисплазий.

Известно, что ахондроплазия – заболевание, требующее хирургической коррекции, является следствием генной мутации в одной из хромосом 4-й пары в локусе, соответствующем кодированию аминокислотной последовательности полипептидной цепи тирозинкиназы, являющейся трансмембранным рецептором фактора роста фибробластов 3. При этой патологии наблюдаются дефекты во взаимодействии на оси соматотропный гормон – соматомедины, а также низкая активность факторов эритропоэза. Отклонения физического развития детей с ахондроплазией обусловлены как генной мутацией, так и образом жизни и социальным статусом. Непропорциональное развитие тела и низкий рост порождает целый ряд проблем, решить которые можно, прибегнув к устранению нарушения длины и формы конечностей методом чрескостного дистракционного остеосинтеза.

К началу 80-х гг. прошлого века задача увеличения роста оперативным путем у больных с врожденным системным недоразвитием осевого скелета была решена посредством применения полилокального полисегментарного чрескостного дистракционного остеосинтеза. К настоящему времени актуальной остается проблема выявления критериев продолжительности и интенсивности хирургической коррекции и разработки новых, надежных методов лабораторного мониторинга течения репаративного процесса, а также связанных с ним изменениях, происходящих в организме на фоне хирургического вмешательства [4].

Существует множество способов оценки течения репаративного процесса, в основе которых лежит определение активности костных рострегулирующих факторов. Одним из них является биотестирование сыворотки крови, предложенное Ю.П. Балдиным и К.С. Десятниченко. Известно, что ряд фракций неколлагеновых белков костной ткани оказывают влияние на остеогенез и гемопоэз. Следовательно, оценивая характер влияния компонентов сыворотки на состав периферической крови, можно сделать заключение о состоянии регенераторного потенциала организма [5].

Феномен изменения клеточного пейзажа периферической крови вследствие костной травмы, а также факт наличия общих предшественников у форменных элементов крови и остеогенных клеток позволяет констатировать существующую взаимосвязь гемопоэза и остеогенеза [2,7]. Регуляция остеогенеза и гемопоэза в организме осуществляется как на системном, так и на местном уровне, в котором принимают участие цитокины и факторы роста различной природы. Исследования ряда последних лет показали, что их присутствие в циркуляторном русле обуславливает остеогенный эффект сыворотки крови пациентов с активным остеогенезом [1]. Причем, повреждение опорно-двигательного аппарата при оперативных вмешательствах и костных травмах является основным условием их интенсивного поступления в циркуляторное русло. Таким образом, активность факторов остеогенеза отражает состояние репаративного процесса в организме.

Различные методики биотестирования сыворотки крови применяются в практическом здравоохранении [3], однако работы, посвященные данному вопросу в области ортопедии, практически отсутствуют в научной литературе.

Цель исследования – изучить возможность использования результатов биотестирования сыворотки крови пациентов с ахондроплазией на различных этапах остеосинтеза для определения их регенераторного статуса.

Материалы и методы

Материалами биохимических исследований были сыворотка крови 52 больных ахондроплазией обоего пола в возрасте от 6 до 14 лет. Сыворотку крови получали за несколько дней до операции, в первые 3–5 дней послеоперационного периода, далее 1 раз в неделю с начала дистракции и 2 раза в неделю на этапе фиксации. Кроме этого, материал для исследований получали в отдаленные сроки после снятия аппарата Илизарова. Кровь для анализа получали венепункцией и собирали в гепаринизированные пробирки, сыворотку отделяли центрифугированием (ЦЛР-1, 3000 об/мин).

Выделение материала для биотестирования проводили следующим образом. Из 0,1 мл сыворотки крови больного выделяли компоненты, преципитирующие в диапазоне насыщения сульфата аммония >30-<50 %. Из преципитата выделяли фракции, сорбирующиеся на ДЭАЭ-целлюлозе. Полученные пробы подвергали диализу против дистиллированной воды и лиофильно высушивали. Полученный лиофилизат растворяли 0,04 мл физиологического раствора, которые подкожно вводили белым лабораторным мышам массой 24–26 грамм. Исследование количества форменных элементов крови мышей производили в камере Горяева. Подсчет лейкоцитарной формулы – из расчета на 100 клеток при окрашивании по Романовскому – Гимза. Подсчет количества ретикулоцитов на 1000 эритроцитов – на предметном стекле, окраска бриллиантовым крезиловым синим. Кровь у мышей отбирали из хвостовой вены. Исследования проводили до введения исследуемых фракций и через 48 часов после введения. Изменение содержания в периферической крови исследуемых клеток выражали в процентах от исходного уровня. Гематологические исследования проведены С.П. Изотовой.

Все манипуляции с экспериментальными животными были проведены в соответствии с отечественными и европейскими требованиями по обращению с экспериментальными животными. Математическая обработка результатов включала в себя вычисление медианы, 25 % и 75 % процентиля. Достоверность отличий в группах определяли, используя критерии Вилкоксона для связанных и несвязанных выборок.

Результаты исследований и их обсуждение

Для поддержания нормального процесса ремоделирования костной ткани необходимо наличие соответствующего костномозгового микроокружения. Синтезируемые стромальными клетками и поступающие гуморальным путем цитокины играют существенную роль в процессах костного ремоделирования. Они включают в себя интерлейкины, факторы некроза опухоли, колониестимулирующие факторы и др. Трансформирующий фактор роста b (ТФРb) играет важную роль при образовании, ремоделировании и репарации кости. Было обнаружено, что ТФРb способен ингибировать костную резорбцию, индуцируемую другими факторами, повышать активность щелочной фосфатазы. Однако в зависимости от условий культивирования и наличия других регуляторов роста ТФРb может играть роль ингибитора пролиферативных и биосинтетических процессов в тех же кле­тках, на которые он оказывал стимулирующий эффект.

Изменения гемопоэтической активности сыворотки крови имеет место сразу после оперативного вмешательства. Однако в первые дни после операции активация гемопоэза (по уровню ретикулоцитов) не столь значительна, как в период третьей и четвертой недели после начала дистракции, когда по сравнению с дооперационным уровнем увеличение содержания ретикулоцитов в периферической крови экспериментальных животных достигает 300 % и более (Рис. 1). В последующие периоды происходит плавное снижение способности модифицированных компонентов крови пациентов с ахондроплазией стимулировать изменения количества ретикулоцитов в периферической крови мышей. К концу периода фиксации значения приближаются к дооперационным.

Изменения содержания моноцитов в периферической крови мышей имели схожий характер (Рис. 2). Наибольшие изменения фиксировались на 3 и четвертой неделе дистракции. На более поздних сроках фиксации появляется тенденция к росту активности фракций, оказывающих влияние на активность пролиферации моноцитов.

Характерно подавление эритропоэза у мышей в ответ на введение модифицированных компонентов сыворотки крови больных ахондроплазией. Сразу после операции происходит достоверное изменение исследованных показателей гемопоэза. С началом дистракции в сыворотке крови начинают преобладать компоненты, активизирующие процессы эритропоэза. В сроки, следующие после 1 месяца дистракции, происходит снижение этих показателей. Способность компонентов крови, активированной остеогенезом оказывать влияние на гемопоэз, по всей видимости обусловлена наличием в ее составе повышенного уровня различных цитокинов и факторов роста.

Рис.1. Изменение активации гемопоэза на этапах удлинения конечностей методом чрескостного дистракционного остеосинтеза по уровню ретикулоцитов на оси абсцисс – отмечены сроки лечения: (1 – до операции (n=18), 2 – 5 дней после операции (n=15), 3 – неделя дистракции (n=15), 4 – 1 месяц дистракции (n=17), 5 – 2 месяца дистракции (n=19), 6 – более 3 месяцев дистракции (n=14), 7 – 1 месяц фиксации (n=16), 8 – 3 месяца фиксации (n=12), 9 – после снятия аппарата (n=10))

Рис.2. Изменение содержания моноцитов в периферической крови мышей, в ответ на введение компонентов сыворотки больных с ахондроплазией, на этапах удлинения конечностей методом чрескостного остеосинтеза на оси абсцисс – отмечены сроки лечения: (1 – до операции (n=18), 2 – 5 дней после операции (n=15), 3 – неделя дистракции (n=15), 4 – 1 месяц дистракции (n=17), 5 – 2 месяца дистракции (n=19), 6 – более 3 месяцев дистракции (n=14), 7 – 1 месяц фиксации (n=16), 8 – 3 месяца фиксации (n=12), 9 – после снятия аппарата (n=10))

Компоненты сыворотки крови больных ахондроплазией, выделенные по предлагаемой методике, подавляют эритропоэз у мышей. Сразу после операции происходит достоверное увеличение показателей гемопоэза, что говорит об активизации процессов ремоделирования в системе костной ткани.

С началом дистракции в сыворотке крови начинают преобладать компоненты, активизирующие процессы эритропоэза. В сроки, следующие после 1 месяца дистракции, происходит снижение этих показателей. На более поздних сроках фиксации появляется тенденция к росту активности фракций, оказывающих влияние на активность пролиферации моноцитов, что может быть связано с активацией процессов ремоделирования новообразованной костной ткани. Полученные результаты иллюстрируют течение репаративного остеогенеза при ЧДО и согласуются с клиническими данными [6].

Продолжение исследований в этом направлении позволило бы сформировать группы ортопедических больных с различным характером течения репаративного процесса и на основе этого разработать критерии оценки регенераторного статуса пациентов.

Выводы

1. Внутрибрюшинное введение модифицированных компонентов сыворотки крови пациентов с ахондроплазией приводит к угнетению эритропоэза у мышей.

2. Модифицированные компоненты сыворотки крови пациентов с ахондроплазией, взятые в период 3 и 4 недели дистракции, вызывают значительную активацию гемопоэза при внутрибрюшинном введении лабораторным мышам.

3. Предложенный способ биотестирования сыворотки крови пациентов ортопедического профиля, находящихся на этапах лечения методами чрескостного остеосинтеза, может быть использован в составе комплексной оценки протекания процесса костной регенерации.

Рецензенты:

Матвеева Е.Л., д.б.н., ведущий научный сотрудник, ФГБУ «РНЦ «ВТО» имени академика Г. А. Илизарова» Минздрава России, г. Курган;

Стогов М.В., д.б.н., ведущий научный сотрудник, ФГБУ «РНЦ «ВТО» имени академика Г. А. Илизарова» Минздрава России, г. Курган.


Библиографическая ссылка

Ковинька М.А. БИОТЕСТИРОВАНИЕ СЫВОРОТКИ КРОВИ С ЦЕЛЬЮ ОЦЕНКИ ТЕЧЕНИЯ РЕПАРАТИВНОГО ПРОЦЕССА У ПАЦИЕНТОВ С АХОНДРОПЛАЗИЕЙ // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 5. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=22560 (дата обращения: 23.09.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074