Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Колтунов Е.В. 1 Яковлева М.И. 1

---

1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Ботанический сад Уральского отделения Российской академии наук»

Несмотря на интенсивные исследования биохимических аспектов резистентности к гнилевым болезням, роль фенольных соединений остается недостаточно выясненной, а имеющиеся данные противоречивы. Это и определило цели и задачи исследований. Градиентный хроматографический анализ (ВЭЖХ) образцов из листьев березы повислой, взятых как с деревьев, пораженных стволовой гнилью, так и здоровых, позволил выявить 57 фенольных соединений. Тотальный попарный сравнительный анализ образцов листьев пораженных и контрольных древостоев показал, что эти образцы значительно отличались между собой. Так, у 35,9% фракций их содержание заметно увеличивалось, у такого же количества уменьшалось, у 28,2% не изменялось. У 50% идентифицированных нами фенольных соединений их содержание заметно увеличивалось. Это галловая к-та (161,88%), 4-кофеоилхинная к-та (36,93%), рутин (61,95%), 5-кофеоилхинная к-та (58,0%), изокверцетин (252,2%), мирицетин (96,44%) и кверцетин (51,66%). Одновременно снижается уровень активности аскорбиновой к-ты, арбутина, салицина, кафтаровой к-ты, гиперозида. Учитывая, что большинство идентифицированных нами фенольных соединений являются активными антиоксидантами, можно заключить, что биохимические процессы борьбы с оксидативным стрессом у березы, пораженной стволовой гнилью, заметно активизируются. Мы предполагаем, что это обусловлено защитной реакцией дерева-хозяина на заражение гнилевыми болезнями. Кроме того, обращает внимание ингибирование синтеза фенолгликозидов (арбутина, салицина) в насаждениях, пораженных стволовыми гнилями, детерминирующих параметры индуцированной энтоморезистентности. Полученные результаты предполагают, что развитие гнилевых болезней у березы повислой сопровождается снижением уровня энтоморезистентности. Это хорошо соответствует полученным нами ранее результатам о том, что поражение стволовыми гнилями березы сопровождается заметным снижением энтоморезистентности и возрастанием степени дефолиации крон непарным шелкопрядом, по сравнению со здоровыми деревьями (Колтунов, Клобуков, 2009).

Статья в формате PDF

340 KB

береза повислая

стволовая гниль

фенольные соединения

ВЭЖХ

антиоксидантная активность

1. Абрамова О.С., Пасечник Т.Д., Аверьянов А.А. и др. Фитопатогенный гриб Magnaporthe grisea выделяет антиоксиданты, защищающие его от окислительного повреждения // Совр. микология в России. –М., 2008. – Т.2. – С. 115-116.

2. Колтунов Е.В. Непарный шелкопряд в лесах Евразии. Екатеринбург. Изд-во УрО РАН. 245 с. 2006.

3. Колтунов Е.В., Клобуков Г.И. Влияние стволовой гнили на энтоморезистентность березы повислой (Betula pendula) в системе: береза-непарный шелкопряд. Тр. Всероссийской научно-практической конференции: "Макромицеты бореальной зоны". Красноярск, 2009. С. 113-118.

4. Колтунов Е.В., Залесов С.В. Корневые и стволовые гнили сосны обыкновенной и березы повислой в Нижне-Исетском лесопарке г. Екатеринбурга. Аграрный вестник Урала. № 1 (55). С. 73-75. 2009.

5. Колтунов Е.В., Залесов С.В., Демчук А.Ю. Корневые и стволовые гнили и состояние Шарташского лесопарка г. Екатеринбурга в условиях различной рекреационной нагрузки. Ж-л: Аграрный вестник Урала. 2011 г. № 8. С. 40-44.

6. Полякова Г.Г. Физиологические механизмы иммунитета хвойных на примере взаимодействия флоэмы ствола и офиостомовых грибов // автореф. дисс. д.б.н., Красноярск, 43 с., 2012.

7. Brignolas F., Lieutier F., Sauvard D., Christiansen E., Berryman A.A. Phenolic predictors for Norway spruce resistance to the bark beetle Ips typographus (Coleoptera: Scolytidae) and an associated fungus, Ceratocystis polonica. Can. J. For. Res. 28: 720–728. 1998.

8. Harrison M.J., Dixon R. A. Isoflavonoid accumulation and expression of defense gene transcripts during the establishment of vesicular arbuscular mycorrhizal associations in roots of Medicago truncatula. Mol Plant-Microbe Interact., 6: P. 643–659. 1993.

9. Holopainen J.K., Heijari J., Nerg A.M., Vuorinen M., Kainulainen P. Potential for the use of exogenous chemical elicitors in disease andinsect pest management of conifer seedling production. Open. For. Sci. J. 2: 17-24. 2009.

10. Nafie E., M. Mazen Chemical –Induced Resistance against Brown Stem Rot in Soybean: The Effect of Benzothiadiazole Journal of Applied Sciences Research, 4(12): 2046-2064, 2008.

11. Pausler M., Ayer W.A., Hiratsuka, Y. Benzoic acid, salicylic acid, and the role of black galls on aspen in protection against decay. Can. J. For. Res. 25: P. 1479–1483. 1995.

12. Witzell J., Martín JA. Phenolic metabolites in pathogen resistance of northern forest trees - past experiences and future prospects. Canadian Journal of Forest Research 38: 2711-2727, 2008.

Как известно, одной из важных проблем в лесном хозяйстве Урала являются инфекционные болезни древесного яруса. Вследствие многократного порослевого возобновления и интенсивного антропогенного воздействия пораженность гнилевыми болезнями березняков в лесостепи Зауралья очень высока (60-85%) [4,5].

В целом, несмотря на интенсивные исследования в этом направлении, биохимические аспекты резистентности к гнилевым болезням и взаимодействия в системе: «патоген-растение-хозяин» остаются недостаточно выясненными, так как одни авторы отмечают накопление фенольных соединений в зоне некроза, вызванного инокуляцией патогенов, другие – их снижение [6-8,12].

Наиболее распространенным подходом в исследованиях является изучение биохимических процессов при искусственной инокуляции патогенов в зоне инокуляции. Ряд авторов отмечает, что некоторые фенольные соединения обладают выраженной фунгицидной активностью [10,11]. Имеются также единичные сообщения о том, что микозы у древесных растений сопровождаются активизацией синтеза фенольных соединений, детерминирующих параметры конститутивной резистентности [9]. Таким образом, в целом имеющиеся данные противоречивы. Исходя из этого, нами проведены исследования влияния поражения березы повислой стволовыми гнилями на состав и содержание фенольных соединений в листьях.

Материалы и методы

Для хроматографического анализа проводился сбор листьев березы повислой в Каменск-Уральском р-не Свердловской обл. Пробные площади располагались в березняках вблизи пос. «Покровское». Взятие каждой пробы осуществлялось от нескольких деревьев. Затем пробы смешивались для получения средней пробы. Непосредственно перед отбором проб определяли наличие или отсутствие пораженности дерева стволовыми и корневыми гнилями и стадию развития болезни с помощью взятия кернов из ствола и 3 корневых лап и их анализа. Как показали исследования, в припоселковых березовых лесах средний уровень антропогенной трансформации высок (4 стадия) [2]. Основной источник антропогенного воздействия: рекреационная и пастбищная дигрессия. Контрольные пробы отбирали от здоровых деревьев, не пораженных гнилевыми и другими болезнями, опытные пробы брали с деревьев, идентифицированных нами как пораженные стволовыми гнилями. Отбор проб проводился на одних и тех же пробных площадях, от деревьев одинакового диаметра, растущих в одинаковых лесорастительных условиях. Сразу после сбора листья березы высушивали при 600С, затем размалывали. После этого навеску с 2 г размолотых листьев смешивали с 20 мл 95% этанола. Экстракцию фенольных соединений из листьев березы проводили в обратном холодильнике на водяной бане в течение 30 мин. при кипении раствора. Затем суспензию центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин. Супернатант фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Хроматографию проводили на жидкостном хроматографе Shimadzu LC-20 со спектрофотометрическим УФ детектором. Детектирование элюента осуществляли одновременно на двух полосах поглощения: 254 и 360 нм на колонке PerfectSil Target ODS-35мкм с обращенной фазой.

Градиентное элюирование проводилось в диапазоне 10–50 % со скоростью 1 мл в мин. при температуре 400С. Элюент А – ацетонитрил – 0,05 М фосфатный буферный раствор (рН=3,0); элюент В – ацетонитрил-вода (9:1). Продолжительность хроматографического анализа – 45 мин при 4000С. Из них от 0 до 30 мин. проводилось градиентное элюирование в диапазоне 10-50%, затем в течение 15 мин. при концентрации 50%. Для идентификации фенольных соединений использовали вещества-свидетели фирмы: Fluka, Sigma, Aldrich: аскорбиновая к-та, арбутин, галловая к-та, гиперозид, гидрохинон, кверцетин, изокверцетин, кофейная к-та, мирицетин, рутин, салицин, кафтаровая к-та, рутин; феруловая к-та, 3-КФК, 4-КФК, 5-КФК, кемпферол.

Результаты

Градиентный хроматографический анализ (ВЭЖХ) образцов из листьев березы повислой, взятых как с деревьев, пораженных стволовой гнилью, так и здоровых, позволил выявить 57 фенольных соединений (рис. 1). 

Рис. 1. ВЭЖХ фенольных соединений листьев березы повислой, пораженных стволовой гнилью. По оси абсцисс- tr (время удерживания), ординат-оптическая плотность

Примечания: 1 – аскорбиновая кислота; 4 – арбутин, 5 – галловая кислота; 7 – кафтаровая кислота; 8 – салицин, 13 – 4-кофеоилхинная кислота; 18 – рутин, 21 – 5-кофеоилхинная кислота; 23 – гиперозид; 24 – изокверцетин; 31 – мирицетин; 40 – кверцетин; 43 – кемпферол

Из общего количества фракций нами идентифицировано 13 фенольных соединений. Список идентифицированных фенольных соединений в листьях березы представлен в табл. 1. По химическому составу это были флавоноиды, фенолгликозиды, фенолкарбоновые и гидроксикоричные кислоты.

Для анализа основных, доминирующих тенденций влияния стволовой гнили на содержание фенольных соединений в листьях березы повислой нами проведен как тотальный сравнительный количественный попарный анализ основных выявленных при хроматографии пиков, так и сравнительный анализ идентифицированных нами фенольных соединений (табл. 1).

Таблица 1

Влияние стволовой гнили на состав и содержание фенольных соединений в листьях березы повислой

Тотальный попарный сравнительный анализ образцов листьев пораженных и контрольных древостоев (пиков с идентичным ВУ и спектральным соотношением (S360 /S254)) убедительно продемонстрировал, что эти образцы значительно отличались между собой. Так, у 35,9% фракций их содержание заметно увеличивалось, у такого же количества уменьшалось, у 28,2% не изменялось. Для более глубокого анализа биохимических механизмов, происходящих в клетках листьев березы в насаждениях, пораженных стволовой гнилью, было целесообразно проанализировать тенденции реакций идентифицированных нами на хроматограммах фенольных соединений, так как функции ряда из них хорошо известны.

Как показали результаты исследований, у 50% идентифицированных нами фенольных соединений их содержание заметно увеличивалось. Это галловая к-та (161,88%), 4-кофеоилхинная к-та (36,93%), рутин (61,95%), 5-кофеоилхинная к-та (58,0%), изокверцетин (252,2%), мирицетин (96,44%) и кверцетин (51,66%). Обращает внимание значительный уровень возрастания активности галловой к-ты, изокверцетина и мирицетина. Одновременно снижается уровень активности аскорбиновой к-ты, арбутина, салицина, кафтаровой к-ты, гиперозида. Сравнение полученных нами результатов с имеющимися в литературе не дает положительных результатов, так как нами изучались биохимические изменения на значительной стадии пораженности, когда площадь пораженной древесины превышала 30% по диаметру, тогда как другие авторы изучали чаще биохимический состав после непосредственной инокуляции патогена. Так, синтез таких фенолгликозидов, как арбутин и салицин не активируется, но, в целом общий уровень активности идентифицированных соединений значительно возрастает.

Учитывая то, что большинство идентифицированных нами фенольных соединений являются активными антиоксидантами, можно заключить, что биохимические процессы борьбы с оксидативным стрессом у березы, пораженной стволовой гнилью, заметно активизируются. Вместе с тем, известно, что некоторые патогенные грибы сами выделяют антиоксиданты для разрушения Н2О2 и супероксидного радикала, которые выполняют защитную функцию, способствующую выживанию патогена (Абрамова и др., 2008). Поэтому возможно, что столь заметное увеличение активности ряда фенольных соединений, обладающих высокой антиоксидантной активностью, обусловлено защитной реакцией дерева-хозяина на заражение гнилевыми болезнями. Вместе с тем, мы предполагаем, что это одна из дополнительных функций фенольных соединений. Кроме того, обращает внимание ингибирование синтеза фенолгликозидов (арбутина, салицина) в насаждениях, пораженных стволовыми гнилями, детерминирующих параметры индуцированной энтоморезистентности. Полученные результаты предполагают, что развитие гнилевых болезней у березы повислой может сопровождаться снижением уровня энтоморезистентности. Это хорошо соответствует полученным нами ранее результатам о том, что поражение стволовыми гнилями березы сопровождается заметным снижением энтоморезистентности и возрастанием степени дефолиации крон непарным шелкопрядом, по сравнению со здоровыми деревьями (Колтунов, Клобуков, 2009).

Рецензенты:

Усольцев В.А., д.с.-х.н., профессор, профессор Уральского государственного лесотехнического университета, г. Екатеринбург;

Менщиков С.Л., д.с.-х.н., заведующий лабораторией экологии техногенных растительных сообществ ФГБУН Ботанический сад Российской Академии наук, г. Екатеринбург.

Библиографическая ссылка