Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

ЭКСПРЕССИЯ МИКРОРНК В МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОДТИПАХ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Веряскина Ю.А. 2 Титов С.Е. 1, 2 Родионов В.В. 4, 3 Генинг Т.П. 3 Абакумова Т.В. 3 Кометова В.В. 4 Торосян М.Х. 4 Жимулев И.Ф. 2 Колесников Н.Н. 2
1 ЗАО ”Вектор-Бест”
2 Институт Молекулярной и Клеточной биологии СО РАН
3 ФГБОУ ВПО Ульяновский государственный университет
4 ГУЗ Ульяновский областной клинический онкологический диспансер
С целью определения различий в экспрессии миРНК в опухолевой ткани различных молекулярно-генетических подтипов рака молочной железы и смежной условно нормальной ткани молочной железы методом ОТ-ПЦР в реальном времени оценивали уровень экспрессии миРНК-21, 221, 222, 155, 205, 20а, 125b и 200а. Установлено значительное увеличение уровня экспрессии онкогенных миРНК-20a (p=0.000141) и миРНК-221(p=0.037777) в тройном негативном раке в сравнении с люминальным А и люминальным В/HER2/neu-негативным подтипами рака молочной железы. Оценка значимости полученных результатов проведена при помощи ROC анализа. Для миРНК-221 значение AUC = 0.772, для миРНК-20a значение AUC=0.949. Таким образом, миРНК-20a является значимым классификатором для дифференциации наиболее агрессивного рака молочной железы с тройным негативным фенотипом.
ROC-анализ
микроРНК
рак молочной железы
1. Колесников Н.Н. МикроРНК, Эволюция и рак /Н.Н. Колесников, С.Е. Титов, Ю.А. Веряскина и др. // Цитология. – 2013. – Т.55, № 3. – С.159-164.
2. Chen C. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR / C. Chen, Ridzon D.A., Broomer A.J., et al. // NucleicAcidsRes. – 2005. – Vol. 33(20). – P.179
3. Chen J. MicroRNA-21 in breast cancer: diagnostic and prognostic potential / J. Chen, X.Wang // Clin Transl Oncol. – 2014. – Vol.16(3). – P.225-33.
4. Feliciano A., Castellvi J., Artero-Castro A., et al. miR-125b acts as a tumor suppressor in breast tumorigenesis via its novel direct targets ENPEP, CK2-α, CCNJ, and MEGF9. / A. Feliciano, Castellvi J., Artero-Castro A., et al. // PLoS One. – 2013. – Vol.8(10). – P.76247.
5. Kim K. Identification of oncogenic microRNA-17-92/ZBTB4/specificity protein axis in breast cancer / K. Kim, Chadalapaka G., Lee S.O., et al. // Oncogene. – 2012. – Vol.31(8). – P.1034-44.
6. Korpal M., B.J.Ell, F.M.Buffa, et al. Direct targeting of Sec23a by miR-200s influences cancer cell secretome and promotes metastatic colonization / M. Korpal, B.J.Ell, F.M.Buffa, et al. // Nat Med. – 2011. – Vol.17(9). – P.1101-8.
7. Mattiske S. The oncogenic role of miR-155 in breast cancer. / S. Mattiske, R.J.Suetani, P.M.Neilsen, D.F. Callen // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. – 2012. – Vol.21(8). – P.1236-43.
8. Parikh R.R. Prognostic value of triple-negative phenotype at the time of locally recurrent, conservatively treated breast cancer / R.R. Parikh, D.Housman, Q.Yang, D.Toppmeyer, L.D.Wilson, B.G. Haffty // Int J Radiat Oncol Biol Phys. – 2008. – Vol.72(4). – P.1056-63
9. Qi L. Expression of miR-21 and its targets (PTEN, PDCD4, TM1) in flat epithelial atypia of the breast in relation to ductal carcinoma in situ and invasive carcinoma / L. Qi, J.Bart, L.P.Tan, et al. // BMC Cancer. – 2009. – Vol.9. – P.163.
10. Rounak Nassirpour miR-221 Promotes Tumorigenesis in Human Triple Negative Breast Cancer Cells / Nassirpour Rounak, P. Mehta Pramod, M. Baxi Sangita, Yin.Min-Jean //PLoS One. – 2013. –Vol. 8(4). – P.62170.
11. Ryan M. O'Connell. MicroRNA-155 is induced during the macrophage inflammatory response / M. O'Connell Ryan, Konstantin D. Taganov, Mark P. Boldin, Genhong Cheng, and David Baltimore.// Proc Natl Acad Sci U S A. – 2007. – Vol.104(5). – P.1604-9.
12. Thiery J.P. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease / J.P. Thiery, H.Acloque, R.Y.Huang, M.A.Nieto // Cell. – 2009. – Vol.139(5). – P.871-90.
13. Wang Z. miRNA-205 affects infiltration and metastasis of breast cancer / Z. Wang, , H.Liao, Z.Deng, P.Yang, N.Du, Y.Zhanng, H.Ren // Biochem Biophys Res Commun. – 2013. – Vol. 441(1). – P.139-43.
14. Zhang Y. miR-125b is methylated and functions as a tumor suppressor by regulating the ETS1 proto-oncogene in human invasive breast cancer / Y. Zhang, L.X.Yan, Q.N.Wu, et al. // Cancer Res. – 2011. – Vol.71(10). – P.3552-62.
Рак молочной железы (РМЖ) - злокачественное новообразование, развивающееся из клеток эпителия протоков и долек паренхимы молочной железы. В экономически развитых странах РМЖ - наиболее частая форма онкологического заболевания женщин. Самые высокие стандартизованные показатели заболеваемости РМЖ - 32 % всех случаев впервые диагностированных случаев рака у женщин, - зарегистрированы в США. В России в 2006 году распространенность РМЖ среди пациентов со злокачественными опухолями составила 17,8 %. Исследование венозной крови на опухолевые маркеры не является высокоспецифичным, его не используют для первичной диагностики РМЖ. Определение молекулярных опухолевых маркеров имеет прогностическое значение. В конце 90-х годов прошлого века в группе раков молочной железы были выделены опухоли, в которых не обнаруживаются рецепторы эстрогенов прогестерона и не наблюдается амплификация гена HER-2-nеu, - так называемый тройной негативный РМЖ [8]. На сегодня установлено, что примерно в 80 % случаев трижды негативный и базальный РМЖ совпадают. Но трижды негативный РМЖ включает в себя и некоторые особые гистологические типы.  Окрашивание на базальные кератины при этом считается недостаточно воспроизводимым для широкого использования. На практике клиницисты сталкиваются с ситуациями, когда люминальные подтипы РМЖ, характеризующиеся наиболее благоприятным течением,  ведут себя крайне агрессивно, при этом заболевание быстро прогрессирует и нередко заканчивается летальным исходом. И наоборот, наиболее агрессивный рак с тройным негативным фенотипом может протекать индолентно годами и не требовать адъювантных терапевтических методов лечения. Всё это требует поиска дополнительных молекулярно-генетических маркеров, позволяющих максимально индивидуализировать лечение больных РМЖ. Открытие молекул-ингибиторов синтеза белков на посттранскрипционном уровне -  микроРНК(миРНК) предоставило новые возможности в поиске специфических маркеров новообразований. Показано, что каждый тип опухолей человека обладает уникальным набором экспрессируемых миРНК, и опухоль специфические  миРНК в биологических тканях больного стабильны.  В связи с вышеизложенным, целью настоящего исследования явилось определение различий в экспрессии миРНК в опухолевой ткани инвазивной карциномы молочной железы по сравнению с нормальной тканью, а также анализ вариабельной экспрессии миРНК в молекулярно-генетических подтипах РМЖ. 

Материалы и методы. Материалом для исследования послужили 35 биоптатов опухолевой ткани и 35 биоптатов смежной условно нормальной ткани, соответственно, полученных в ходе оперативного радикального лечения 35 пациенток с диагнозом рак молочной железы в ГУЗ Областной клинический онкологический диспансер г. Ульяновска в 2014 году. Хирургическое лечение проводилось без предварительного химиолучевого воздействия.  Средний возраст пациенток составил 50±5,3 года. Стадия процесса была подтверждена патоморфологически после выполнения оперативного лечения и определялась согласно международной классификации TNM в 7 редакции от 2010 г. В 11 случаях была диагностирована I стадия заболевания, в 17 случаях - II стадия, в 7 случаях - III стадия. В 26 биоптатах опухолевой ткани молочной железы были выявлены люминальный  А и люминальный В/HER2/neu-негативный РМЖ; в  6 случаях был рак с тройным негативным фенотипом; в 1 биоптате был диагностирован люминальный/HER2/neu-позитивный рак и в 2 случаях - HER2/neu-позитивная карцинома. Ввиду малого числа наблюдений в двух последних подтипах в анализ включены пациенты с люминальным А и люминальный В/HER2/neu-негативным подтипами РМЖ. Для хранения и транспортировки операционного материала использовался раствор для стабилизации РНК RNA later, позволяющий выделять РНК из тканей и клеток без замораживания в жидком азоте. Выделение суммарного пула РНК проводили с помощью набора «Реал Бест экстракция 100» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск) в соответствии с инструкцией производителя. Обратная транскрипция была проведена при помощи специфичных праймеров к миРНК: миРНК-21, миРНК-221, миРНК-222, миРНК-155, миРНК-205, миРНК-20a, миРНК-125b, миРНК-146b, миРНК-200a. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием готовой реакционной смеси «Реал Бест Мастер микс ОТ» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск). Полученную кДНК, в объеме 3 мкл сразу использовали в качестве матрицы для проведения ПЦР. Измерение уровней экспрессии миРНК проводили методом ПЦР в реальном времени на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США) [2]. В качестве референсного гена использовали малую РНК U6. Реакцию ПЦР проводили в объеме 30 мкл с использованием готовой реакционной смеси «Реал Бест Мастер микс» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск) и раствора прямого и обратного праймеров (5 мкМ) и зонда (2.5 мкМ). Уровень экспрессии миРНК измерен при помощи метода ОТ - ПЦР в реальном времени. Статистическая обработка проводилась с применением  непараметрического U-критерия Манна - Уитни в программе Statistica 10.0. Для того чтобы  оценить значимость выявленных различий, проведена математическая  обработка методом построения ROC - кривой с использованием программного обеспечения IBM SPSS Statistics 21.

Результаты и обсуждение. Все миРНК разделены на онкогены и онкосупрессоры в зависимости от их роли в канцерогенезе РМЖ. МиРНК является онкогенной, если ее мишенью является онкосупрессорный ген, и наоборот, миРНК является онкосупрессорной, если её мишенью является онкоген. Стоит отметить, что одна миРНК может выступать как в роли онкогена, так и в роли онкосупрессора в зависимости от гена мишени, а также ткани, в которой она экспрессируется [1]. Проведен анализ экспрессии девяти миРНК: миРНК-21, -221, -222, -155, -205, -20a, -125b, -146b,  -200a в опухолевой ткани люминального А и люминального В/HER2/neu-негативного подтипов РМЖ в сравнении с прилежащей морфологически неизменной тканью. Были получены статистически значимые различия уровня экспрессии для семи  миРНК:  миРНК-21,-221,-222,-155,-205,-125b,-200a. Наиболее значимые различия в опухолевой ткани и в прилежащей морфологически неизмененной ткани (более  чем в 3 раза)  наблюдали  для двух онкогенных миРНК: миРНК - 155 и миРНК - 21 и двух онкосупрессорных миРНК: миРНК-205 и миРНК-125b (Табл.1). В ряде исследований было показано, что миРНК-21 является онкогеном и  ингибирует  опухолевые супрессоры  Pdcd4 и PTEN [9], а также коррелирует со стадией злокачественного процесса [3]. Одновременно было показано, что миРНК-155 также является онкогеном и участвует во множестве клеточных процессов, таких как регуляция пролиферации, миграция, вторжение, эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) и иммунный ответ [11,7]. Wang и соавт. показали, что в культуре клеток  РМЖ избыточная экспрессия миРНК-205 ингибирует пролиферацию, усиливает апоптоз, и уменьшается вторжение раковых клеток молочной железы, характеризуя миРНК-205 как онкосупрессор [13]. МиРНК-125b также является онкосупрессором для РМЖ и уменьшает пролиферативную активность  клеток [4,14]. Таким образом, миРНК-205 и миРНК-125b играют ключевую роль в прогрессировании и развитии рака молочной железы.  Так же стоит обратить внимание на  увеличение уровня экспрессии миРНК-200а почти в 2 раза в опухолевых образцах по сравнению с прилежащей морфологически неизмененной тканью (Табл.1). Семейство миРНК-200 регулирует ЭМП в различных типах рака, а также  коррелирует с наличием легочных метастазов [12,6].

Таблица 1

Изменение уровня экспрессии миРНК в опухолевой ткани люминального А и люминального В/HER2/neu-негативного подтипов РМЖ по сравнению с прилежащей морфологически неизмененной тканью

 

миРНК

155

21

200а

146b

205

125b

221

222

20a

Различие

3.68

3.66

1.78

1.02

7.84

7.78

1.71

1.56

1.17

Динамика

увеличение

понижение

P

0.000096

0.000980

0.082627

0.744125

0.000050

0.000020

0.006062

0.016630

0.212682

Примечания:  p<0.05 - различия статистически значимы между опухолевой тканью и прилежащей морфологически неизмененной тканью.

Проведен анализ экспрессии девяти миРНК: миРНК-21, -221, -222, -155, -205, -20a, -125b, -146b,  -200a в опухолевой ткани у пациенток с тройным негативным фенотипом РМЖ (ТНРМЖ) в сравнении с прилежащей морфологически неизменнной тканью. Были получены статистически значимые различия уровня экспрессии для трёх миРНК: миРНК-20a,-205,-125b (Табл.2). Во множестве исследований было показано, что миРНК-20a является онкогеном и сверхэкспрессируется при РМЖ [5]. Также  мы наблюдали значительное снижение (более чем в 3 раза) уровня экспрессии двух онкосупрессорных миРНК: миРНК-125b и миРНК-205 в опухолевой ткани в сравнении с  прилежащей морфологически неизмененной тканью. Как было описано выше миРНК-205 и миРНК-125b являются ключевыми участниками  канцерогенеза, и их пониженная экспрессия ассоциирована с неблагоприятным прогнозом РМЖ. Кроме того, мы наблюдали тенденцию к увеличению уровня экспрессии онкогенных миРНК -21 и миРНК-155 в опухолевой ткани тройного негативного РМЖ в сравнении с прилежащей морфологически неизменной тканью.

Таблица 2

Изменение уровня экспрессии миРНК в опухолевой ткани ТНРМЖ по сравнению с прилежащей морфологически неизмененной тканью

 

миРНК

155

21

20а

200a

146b

125b

205

222

221

Различие

7.01

3.23

3.16

2.52

1.97

10.45

3.50

1.86

1.12

Динамика

увеличение

понижение

P

0.111111

0.055555

0.031746

0.095238

0.547619

0.015873

0.007936

0.547619

0.841269

Примечания:  p<0.05 - различия статистически значимы между опухолевой тканью и прилежащей морфологически неизмененной тканью.

Проведено сравнение значений 2-∆∆Ct выбранной группы миРНК между пациентами с люминальными подтипами РМЖ и пациентами с ТНРМЖ (Табл. 3).

Таблица 3

Изменение экспрессии миРНК в ТНРМЖ по сравнению с люминальными подтипами РМЖ.

миРНК

Различие

Динамика

P

миРНК  - 221

43.03

увеличение

0.0377779

миРНК  - 222

11.3

увеличение

0.2246853

миРНК  - 20a

6.42

увеличение

0.0001413

миРНК  - 200a

2.39

увеличение

0.0965447

миРНК  - 155

2.33

увеличение

0.3078420

миРНК  - 21

1.99

увеличение

0.3813739

миРНК  - 146b

1.63

увеличение

0.1185532

миРНК  - 125b

1.89

понижение

0.2641339

миРНК  - 205

1.01

понижение

0.8265458

Примечания:  p<0.05 - различия статистически значимы между опухолевой тканью и прилежащей морфологически неизмененной тканью

Мы установили, что уровень экспрессии онкогенной миРНК-221 в 43 раза выше в ТНРМЖ, чем в люминальном А и люминальном В/HER2/neu-негативном подтипах РМЖ (p<0.05). МиРНК-221 является онкогеном и  регулирует два ключевых механизма в развитии опухоли: ингибирует супрессор p27 и способствует переходу ЭМП путем ингибирования E-кадгерина. По всей вероятности, миРНК-221 играет важную роль в ТНРМЖ [10]. Мы также установили, что уровень онкогенной миРНК-20a повышен почти в 7 раз в ТНРМЖ в сравнении с люминальными подтипами РМЖ (p<0.001). Таким образом, повышенная экспрессия онкогенных миРНК-221 и миРНК-20a является отличительной характеристикой ТНРМЖ и характеризует более агрессивное его течение. ROC-анализ позволил установить, что значение AUC для миРНК-221равно 0.772, что говорит о высокой значимости данного критерия в понимании различий между тройным негативным и люминальными подтипами РМЖ. Значение AUC для миРНК-20a равно 0.949, что делает его отличным маркером ТНРМЖ.

Заключение

Таким образом, полученные результаты позволили сформировать уникальный  профиль экспрессии миРНК для различных молекулярно-генетических подтипов РМЖ. Уровни экспрессии онкогенных миРНК-221 и миРНК-20a повышены в ТНРМЖ в сравнении с люминальным А и люминальным В/HER2/neu-негативным подтипами РМЖ, подтверждая характеристику ТНРМЖ, как наиболее агрессивного подтипа РМЖ. Для оценки значимости полученных различий проведен ROC анализ. Для миРНК-20a значение AUC равно 0.949. Таким образом, миРНК-20a является маркером ТНРМЖ в сравнении с люминальными подтипами РМЖ.

Рецензенты:

Антонеева И.И., д.м.н., заведующая гинекологическим отделением ГУЗ Областной клинический онкологический диспансер, врач высшей квалификационной категории, г. Ульяновск;

Демаков С.А., д.б.н., заведующий лабораторией хромосомной инженерией ИМКБ СО РАН, г. Новосибирск.


Библиографическая ссылка

Титов С.Е., Родионов В.В., Веряскина Ю.А., Титов С.Е., Родионов В.В., Генинг Т.П., Абакумова Т.В., Кометова В.В., Торосян М.Х., Жимулев И.Ф., Колесников Н.Н. ЭКСПРЕССИЯ МИКРОРНК В МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОДТИПАХ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 5. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=21656 (дата обращения: 29.09.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074