Материалы и методы. Материалом для исследования послужили 35 биоптатов опухолевой ткани и 35 биоптатов смежной условно нормальной ткани, соответственно, полученных в ходе оперативного радикального лечения 35 пациенток с диагнозом рак молочной железы в ГУЗ Областной клинический онкологический диспансер г. Ульяновска в 2014 году. Хирургическое лечение проводилось без предварительного химиолучевого воздействия. Средний возраст пациенток составил 50±5,3 года. Стадия процесса была подтверждена патоморфологически после выполнения оперативного лечения и определялась согласно международной классификации TNM в 7 редакции от 2010 г. В 11 случаях была диагностирована I стадия заболевания, в 17 случаях - II стадия, в 7 случаях - III стадия. В 26 биоптатах опухолевой ткани молочной железы были выявлены люминальный А и люминальный В/HER2/neu-негативный РМЖ; в 6 случаях был рак с тройным негативным фенотипом; в 1 биоптате был диагностирован люминальный/HER2/neu-позитивный рак и в 2 случаях - HER2/neu-позитивная карцинома. Ввиду малого числа наблюдений в двух последних подтипах в анализ включены пациенты с люминальным А и люминальный В/HER2/neu-негативным подтипами РМЖ. Для хранения и транспортировки операционного материала использовался раствор для стабилизации РНК RNA later, позволяющий выделять РНК из тканей и клеток без замораживания в жидком азоте. Выделение суммарного пула РНК проводили с помощью набора «Реал Бест экстракция 100» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск) в соответствии с инструкцией производителя. Обратная транскрипция была проведена при помощи специфичных праймеров к миРНК: миРНК-21, миРНК-221, миРНК-222, миРНК-155, миРНК-205, миРНК-20a, миРНК-125b, миРНК-146b, миРНК-200a. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием готовой реакционной смеси «Реал Бест Мастер микс ОТ» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск). Полученную кДНК, в объеме 3 мкл сразу использовали в качестве матрицы для проведения ПЦР. Измерение уровней экспрессии миРНК проводили методом ПЦР в реальном времени на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США) [2]. В качестве референсного гена использовали малую РНК U6. Реакцию ПЦР проводили в объеме 30 мкл с использованием готовой реакционной смеси «Реал Бест Мастер микс» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск) и раствора прямого и обратного праймеров (5 мкМ) и зонда (2.5 мкМ). Уровень экспрессии миРНК измерен при помощи метода ОТ - ПЦР в реальном времени. Статистическая обработка проводилась с применением непараметрического U-критерия Манна - Уитни в программе Statistica 10.0. Для того чтобы оценить значимость выявленных различий, проведена математическая обработка методом построения ROC - кривой с использованием программного обеспечения IBM SPSS Statistics 21.
Результаты и обсуждение. Все миРНК разделены на онкогены и онкосупрессоры в зависимости от их роли в канцерогенезе РМЖ. МиРНК является онкогенной, если ее мишенью является онкосупрессорный ген, и наоборот, миРНК является онкосупрессорной, если её мишенью является онкоген. Стоит отметить, что одна миРНК может выступать как в роли онкогена, так и в роли онкосупрессора в зависимости от гена мишени, а также ткани, в которой она экспрессируется [1]. Проведен анализ экспрессии девяти миРНК: миРНК-21, -221, -222, -155, -205, -20a, -125b, -146b, -200a в опухолевой ткани люминального А и люминального В/HER2/neu-негативного подтипов РМЖ в сравнении с прилежащей морфологически неизменной тканью. Были получены статистически значимые различия уровня экспрессии для семи миРНК: миРНК-21,-221,-222,-155,-205,-125b,-200a. Наиболее значимые различия в опухолевой ткани и в прилежащей морфологически неизмененной ткани (более чем в 3 раза) наблюдали для двух онкогенных миРНК: миРНК - 155 и миРНК - 21 и двух онкосупрессорных миРНК: миРНК-205 и миРНК-125b (Табл.1). В ряде исследований было показано, что миРНК-21 является онкогеном и ингибирует опухолевые супрессоры Pdcd4 и PTEN [9], а также коррелирует со стадией злокачественного процесса [3]. Одновременно было показано, что миРНК-155 также является онкогеном и участвует во множестве клеточных процессов, таких как регуляция пролиферации, миграция, вторжение, эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) и иммунный ответ [11,7]. Wang и соавт. показали, что в культуре клеток РМЖ избыточная экспрессия миРНК-205 ингибирует пролиферацию, усиливает апоптоз, и уменьшается вторжение раковых клеток молочной железы, характеризуя миРНК-205 как онкосупрессор [13]. МиРНК-125b также является онкосупрессором для РМЖ и уменьшает пролиферативную активность клеток [4,14]. Таким образом, миРНК-205 и миРНК-125b играют ключевую роль в прогрессировании и развитии рака молочной железы. Так же стоит обратить внимание на увеличение уровня экспрессии миРНК-200а почти в 2 раза в опухолевых образцах по сравнению с прилежащей морфологически неизмененной тканью (Табл.1). Семейство миРНК-200 регулирует ЭМП в различных типах рака, а также коррелирует с наличием легочных метастазов [12,6].
Таблица 1
Изменение уровня экспрессии миРНК в опухолевой ткани люминального А и люминального В/HER2/neu-негативного подтипов РМЖ по сравнению с прилежащей морфологически неизмененной тканью
|
миРНК |
||||||||
155 |
21 |
200а |
146b |
205 |
125b |
221 |
222 |
20a |
|
Различие |
3.68 |
3.66 |
1.78 |
1.02 |
7.84 |
7.78 |
1.71 |
1.56 |
1.17 |
Динамика |
увеличение |
понижение |
|||||||
P |
0.000096 |
0.000980 |
0.082627 |
0.744125 |
0.000050 |
0.000020 |
0.006062 |
0.016630 |
0.212682 |
Примечания: p<0.05 - различия статистически значимы между опухолевой тканью и прилежащей морфологически неизмененной тканью.
Проведен анализ экспрессии девяти миРНК: миРНК-21, -221, -222, -155, -205, -20a, -125b, -146b, -200a в опухолевой ткани у пациенток с тройным негативным фенотипом РМЖ (ТНРМЖ) в сравнении с прилежащей морфологически неизменнной тканью. Были получены статистически значимые различия уровня экспрессии для трёх миРНК: миРНК-20a,-205,-125b (Табл.2). Во множестве исследований было показано, что миРНК-20a является онкогеном и сверхэкспрессируется при РМЖ [5]. Также мы наблюдали значительное снижение (более чем в 3 раза) уровня экспрессии двух онкосупрессорных миРНК: миРНК-125b и миРНК-205 в опухолевой ткани в сравнении с прилежащей морфологически неизмененной тканью. Как было описано выше миРНК-205 и миРНК-125b являются ключевыми участниками канцерогенеза, и их пониженная экспрессия ассоциирована с неблагоприятным прогнозом РМЖ. Кроме того, мы наблюдали тенденцию к увеличению уровня экспрессии онкогенных миРНК -21 и миРНК-155 в опухолевой ткани тройного негативного РМЖ в сравнении с прилежащей морфологически неизменной тканью.
Таблица 2
Изменение уровня экспрессии миРНК в опухолевой ткани ТНРМЖ по сравнению с прилежащей морфологически неизмененной тканью
|
миРНК |
||||||||
155 |
21 |
20а |
200a |
146b |
125b |
205 |
222 |
221 |
|
Различие |
7.01 |
3.23 |
3.16 |
2.52 |
1.97 |
10.45 |
3.50 |
1.86 |
1.12 |
Динамика |
увеличение |
понижение |
|||||||
P |
0.111111 |
0.055555 |
0.031746 |
0.095238 |
0.547619 |
0.015873 |
0.007936 |
0.547619 |
0.841269 |
Примечания: p<0.05 - различия статистически значимы между опухолевой тканью и прилежащей морфологически неизмененной тканью.
Проведено сравнение значений 2-∆∆Ct выбранной группы миРНК между пациентами с люминальными подтипами РМЖ и пациентами с ТНРМЖ (Табл. 3).
Таблица 3
Изменение экспрессии миРНК в ТНРМЖ по сравнению с люминальными подтипами РМЖ.
миРНК |
Различие |
Динамика |
P |
миРНК - 221 |
43.03 |
увеличение |
0.0377779 |
миРНК - 222 |
11.3 |
увеличение |
0.2246853 |
миРНК - 20a |
6.42 |
увеличение |
0.0001413 |
миРНК - 200a |
2.39 |
увеличение |
0.0965447 |
миРНК - 155 |
2.33 |
увеличение |
0.3078420 |
миРНК - 21 |
1.99 |
увеличение |
0.3813739 |
миРНК - 146b |
1.63 |
увеличение |
0.1185532 |
миРНК - 125b |
1.89 |
понижение |
0.2641339 |
миРНК - 205 |
1.01 |
понижение |
0.8265458 |
Примечания: p<0.05 - различия статистически значимы между опухолевой тканью и прилежащей морфологически неизмененной тканью
Мы установили, что уровень экспрессии онкогенной миРНК-221 в 43 раза выше в ТНРМЖ, чем в люминальном А и люминальном В/HER2/neu-негативном подтипах РМЖ (p<0.05). МиРНК-221 является онкогеном и регулирует два ключевых механизма в развитии опухоли: ингибирует супрессор p27 и способствует переходу ЭМП путем ингибирования E-кадгерина. По всей вероятности, миРНК-221 играет важную роль в ТНРМЖ [10]. Мы также установили, что уровень онкогенной миРНК-20a повышен почти в 7 раз в ТНРМЖ в сравнении с люминальными подтипами РМЖ (p<0.001). Таким образом, повышенная экспрессия онкогенных миРНК-221 и миРНК-20a является отличительной характеристикой ТНРМЖ и характеризует более агрессивное его течение. ROC-анализ позволил установить, что значение AUC для миРНК-221равно 0.772, что говорит о высокой значимости данного критерия в понимании различий между тройным негативным и люминальными подтипами РМЖ. Значение AUC для миРНК-20a равно 0.949, что делает его отличным маркером ТНРМЖ.
Заключение
Таким образом, полученные результаты позволили сформировать уникальный профиль экспрессии миРНК для различных молекулярно-генетических подтипов РМЖ. Уровни экспрессии онкогенных миРНК-221 и миРНК-20a повышены в ТНРМЖ в сравнении с люминальным А и люминальным В/HER2/neu-негативным подтипами РМЖ, подтверждая характеристику ТНРМЖ, как наиболее агрессивного подтипа РМЖ. Для оценки значимости полученных различий проведен ROC анализ. Для миРНК-20a значение AUC равно 0.949. Таким образом, миРНК-20a является маркером ТНРМЖ в сравнении с люминальными подтипами РМЖ.
Рецензенты:
Антонеева И.И., д.м.н., заведующая гинекологическим отделением ГУЗ Областной клинический онкологический диспансер, врач высшей квалификационной категории, г. Ульяновск;
Демаков С.А., д.б.н., заведующий лабораторией хромосомной инженерией ИМКБ СО РАН, г. Новосибирск.
Библиографическая ссылка
Титов С.Е., Родионов В.В., Веряскина Ю.А., Титов С.Е., Родионов В.В., Генинг Т.П., Абакумова Т.В., Кометова В.В., Торосян М.Х., Жимулев И.Ф., Колесников Н.Н. ЭКСПРЕССИЯ МИКРОРНК В МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОДТИПАХ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 5. ;URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=21656 (дата обращения: 17.02.2025).