Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

EXPRESSION OF MICRORNAS IN MOLECULAR GENETIC BREAST CANCER SUBTYPES

Veryaskina Yu.A. 2 Titov S.E. 1, 2 Rodionov V.V. 4, 3 Gening T.P. 3 Abakumova T.V. 3 Kometova V.V. 4 Torosyan M.Kh. 4 Zhimulev I.F. 2 Kolesnikov N.N. 2
1 Company"Vector-Best"
2 Institute of Molecular and Cell Biology of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences
3 Ulyanovsk state University
4 Ulyanovsk Regional Clinical Oncology Center
In order to determine differences in expression of miRNA in the tumor tissues of various molecular-genetic subtypes of breast cancer and adjacent conditionally normal breast tissue, we assessed the levels of miRNA-21, 221, 222, 155, 205, 20a, 125b and 200a expressionby real time RT-PCR. A significant increase in the levels of expression of the oncogenic miRNA-20a (p = 0.000141) and miRNA-221 (p = 0.037777) in the triple negative cancer in comparison with the luminal A and luminal B / HER2 / neu-negative breast cancer subtypes was established. Assessment of significance of the results was conducted using ROC analysis. For miRNA-221 AUC value was 0.772, for miRNA-20a AUC was 0.949.Therefore, miRNA-20a is an important qualifier for the differentiation of the most aggressive -triple-negative - breast cancer phenotype.
ROC-analysis
miRNA
breast cancer
Рак молочной железы (РМЖ) - злокачественное новообразование, развивающееся из клеток эпителия протоков и долек паренхимы молочной железы. В экономически развитых странах РМЖ - наиболее частая форма онкологического заболевания женщин. Самые высокие стандартизованные показатели заболеваемости РМЖ - 32 % всех случаев впервые диагностированных случаев рака у женщин, - зарегистрированы в США. В России в 2006 году распространенность РМЖ среди пациентов со злокачественными опухолями составила 17,8 %. Исследование венозной крови на опухолевые маркеры не является высокоспецифичным, его не используют для первичной диагностики РМЖ. Определение молекулярных опухолевых маркеров имеет прогностическое значение. В конце 90-х годов прошлого века в группе раков молочной железы были выделены опухоли, в которых не обнаруживаются рецепторы эстрогенов прогестерона и не наблюдается амплификация гена HER-2-nеu, - так называемый тройной негативный РМЖ [8]. На сегодня установлено, что примерно в 80 % случаев трижды негативный и базальный РМЖ совпадают. Но трижды негативный РМЖ включает в себя и некоторые особые гистологические типы.  Окрашивание на базальные кератины при этом считается недостаточно воспроизводимым для широкого использования. На практике клиницисты сталкиваются с ситуациями, когда люминальные подтипы РМЖ, характеризующиеся наиболее благоприятным течением,  ведут себя крайне агрессивно, при этом заболевание быстро прогрессирует и нередко заканчивается летальным исходом. И наоборот, наиболее агрессивный рак с тройным негативным фенотипом может протекать индолентно годами и не требовать адъювантных терапевтических методов лечения. Всё это требует поиска дополнительных молекулярно-генетических маркеров, позволяющих максимально индивидуализировать лечение больных РМЖ. Открытие молекул-ингибиторов синтеза белков на посттранскрипционном уровне -  микроРНК(миРНК) предоставило новые возможности в поиске специфических маркеров новообразований. Показано, что каждый тип опухолей человека обладает уникальным набором экспрессируемых миРНК, и опухоль специфические  миРНК в биологических тканях больного стабильны.  В связи с вышеизложенным, целью настоящего исследования явилось определение различий в экспрессии миРНК в опухолевой ткани инвазивной карциномы молочной железы по сравнению с нормальной тканью, а также анализ вариабельной экспрессии миРНК в молекулярно-генетических подтипах РМЖ. 

Материалы и методы. Материалом для исследования послужили 35 биоптатов опухолевой ткани и 35 биоптатов смежной условно нормальной ткани, соответственно, полученных в ходе оперативного радикального лечения 35 пациенток с диагнозом рак молочной железы в ГУЗ Областной клинический онкологический диспансер г. Ульяновска в 2014 году. Хирургическое лечение проводилось без предварительного химиолучевого воздействия.  Средний возраст пациенток составил 50±5,3 года. Стадия процесса была подтверждена патоморфологически после выполнения оперативного лечения и определялась согласно международной классификации TNM в 7 редакции от 2010 г. В 11 случаях была диагностирована I стадия заболевания, в 17 случаях - II стадия, в 7 случаях - III стадия. В 26 биоптатах опухолевой ткани молочной железы были выявлены люминальный  А и люминальный В/HER2/neu-негативный РМЖ; в  6 случаях был рак с тройным негативным фенотипом; в 1 биоптате был диагностирован люминальный/HER2/neu-позитивный рак и в 2 случаях - HER2/neu-позитивная карцинома. Ввиду малого числа наблюдений в двух последних подтипах в анализ включены пациенты с люминальным А и люминальный В/HER2/neu-негативным подтипами РМЖ. Для хранения и транспортировки операционного материала использовался раствор для стабилизации РНК RNA later, позволяющий выделять РНК из тканей и клеток без замораживания в жидком азоте. Выделение суммарного пула РНК проводили с помощью набора «Реал Бест экстракция 100» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск) в соответствии с инструкцией производителя. Обратная транскрипция была проведена при помощи специфичных праймеров к миРНК: миРНК-21, миРНК-221, миРНК-222, миРНК-155, миРНК-205, миРНК-20a, миРНК-125b, миРНК-146b, миРНК-200a. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием готовой реакционной смеси «Реал Бест Мастер микс ОТ» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск). Полученную кДНК, в объеме 3 мкл сразу использовали в качестве матрицы для проведения ПЦР. Измерение уровней экспрессии миРНК проводили методом ПЦР в реальном времени на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США) [2]. В качестве референсного гена использовали малую РНК U6. Реакцию ПЦР проводили в объеме 30 мкл с использованием готовой реакционной смеси «Реал Бест Мастер микс» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск) и раствора прямого и обратного праймеров (5 мкМ) и зонда (2.5 мкМ). Уровень экспрессии миРНК измерен при помощи метода ОТ - ПЦР в реальном времени. Статистическая обработка проводилась с применением  непараметрического U-критерия Манна - Уитни в программе Statistica 10.0. Для того чтобы  оценить значимость выявленных различий, проведена математическая  обработка методом построения ROC - кривой с использованием программного обеспечения IBM SPSS Statistics 21.

Результаты и обсуждение. Все миРНК разделены на онкогены и онкосупрессоры в зависимости от их роли в канцерогенезе РМЖ. МиРНК является онкогенной, если ее мишенью является онкосупрессорный ген, и наоборот, миРНК является онкосупрессорной, если её мишенью является онкоген. Стоит отметить, что одна миРНК может выступать как в роли онкогена, так и в роли онкосупрессора в зависимости от гена мишени, а также ткани, в которой она экспрессируется [1]. Проведен анализ экспрессии девяти миРНК: миРНК-21, -221, -222, -155, -205, -20a, -125b, -146b,  -200a в опухолевой ткани люминального А и люминального В/HER2/neu-негативного подтипов РМЖ в сравнении с прилежащей морфологически неизменной тканью. Были получены статистически значимые различия уровня экспрессии для семи  миРНК:  миРНК-21,-221,-222,-155,-205,-125b,-200a. Наиболее значимые различия в опухолевой ткани и в прилежащей морфологически неизмененной ткани (более  чем в 3 раза)  наблюдали  для двух онкогенных миРНК: миРНК - 155 и миРНК - 21 и двух онкосупрессорных миРНК: миРНК-205 и миРНК-125b (Табл.1). В ряде исследований было показано, что миРНК-21 является онкогеном и  ингибирует  опухолевые супрессоры  Pdcd4 и PTEN [9], а также коррелирует со стадией злокачественного процесса [3]. Одновременно было показано, что миРНК-155 также является онкогеном и участвует во множестве клеточных процессов, таких как регуляция пролиферации, миграция, вторжение, эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) и иммунный ответ [11,7]. Wang и соавт. показали, что в культуре клеток  РМЖ избыточная экспрессия миРНК-205 ингибирует пролиферацию, усиливает апоптоз, и уменьшается вторжение раковых клеток молочной железы, характеризуя миРНК-205 как онкосупрессор [13]. МиРНК-125b также является онкосупрессором для РМЖ и уменьшает пролиферативную активность  клеток [4,14]. Таким образом, миРНК-205 и миРНК-125b играют ключевую роль в прогрессировании и развитии рака молочной железы.  Так же стоит обратить внимание на  увеличение уровня экспрессии миРНК-200а почти в 2 раза в опухолевых образцах по сравнению с прилежащей морфологически неизмененной тканью (Табл.1). Семейство миРНК-200 регулирует ЭМП в различных типах рака, а также  коррелирует с наличием легочных метастазов [12,6].

Таблица 1

Изменение уровня экспрессии миРНК в опухолевой ткани люминального А и люминального В/HER2/neu-негативного подтипов РМЖ по сравнению с прилежащей морфологически неизмененной тканью

 

миРНК

155

21

200а

146b

205

125b

221

222

20a

Различие

3.68

3.66

1.78

1.02

7.84

7.78

1.71

1.56

1.17

Динамика

увеличение

понижение

P

0.000096

0.000980

0.082627

0.744125

0.000050

0.000020

0.006062

0.016630

0.212682

Примечания:  p<0.05 - различия статистически значимы между опухолевой тканью и прилежащей морфологически неизмененной тканью.

Проведен анализ экспрессии девяти миРНК: миРНК-21, -221, -222, -155, -205, -20a, -125b, -146b,  -200a в опухолевой ткани у пациенток с тройным негативным фенотипом РМЖ (ТНРМЖ) в сравнении с прилежащей морфологически неизменнной тканью. Были получены статистически значимые различия уровня экспрессии для трёх миРНК: миРНК-20a,-205,-125b (Табл.2). Во множестве исследований было показано, что миРНК-20a является онкогеном и сверхэкспрессируется при РМЖ [5]. Также  мы наблюдали значительное снижение (более чем в 3 раза) уровня экспрессии двух онкосупрессорных миРНК: миРНК-125b и миРНК-205 в опухолевой ткани в сравнении с  прилежащей морфологически неизмененной тканью. Как было описано выше миРНК-205 и миРНК-125b являются ключевыми участниками  канцерогенеза, и их пониженная экспрессия ассоциирована с неблагоприятным прогнозом РМЖ. Кроме того, мы наблюдали тенденцию к увеличению уровня экспрессии онкогенных миРНК -21 и миРНК-155 в опухолевой ткани тройного негативного РМЖ в сравнении с прилежащей морфологически неизменной тканью.

Таблица 2

Изменение уровня экспрессии миРНК в опухолевой ткани ТНРМЖ по сравнению с прилежащей морфологически неизмененной тканью

 

миРНК

155

21

20а

200a

146b

125b

205

222

221

Различие

7.01

3.23

3.16

2.52

1.97

10.45

3.50

1.86

1.12

Динамика

увеличение

понижение

P

0.111111

0.055555

0.031746

0.095238

0.547619

0.015873

0.007936

0.547619

0.841269

Примечания:  p<0.05 - различия статистически значимы между опухолевой тканью и прилежащей морфологически неизмененной тканью.

Проведено сравнение значений 2-∆∆Ct выбранной группы миРНК между пациентами с люминальными подтипами РМЖ и пациентами с ТНРМЖ (Табл. 3).

Таблица 3

Изменение экспрессии миРНК в ТНРМЖ по сравнению с люминальными подтипами РМЖ.

миРНК

Различие

Динамика

P

миРНК  - 221

43.03

увеличение

0.0377779

миРНК  - 222

11.3

увеличение

0.2246853

миРНК  - 20a

6.42

увеличение

0.0001413

миРНК  - 200a

2.39

увеличение

0.0965447

миРНК  - 155

2.33

увеличение

0.3078420

миРНК  - 21

1.99

увеличение

0.3813739

миРНК  - 146b

1.63

увеличение

0.1185532

миРНК  - 125b

1.89

понижение

0.2641339

миРНК  - 205

1.01

понижение

0.8265458

Примечания:  p<0.05 - различия статистически значимы между опухолевой тканью и прилежащей морфологически неизмененной тканью

Мы установили, что уровень экспрессии онкогенной миРНК-221 в 43 раза выше в ТНРМЖ, чем в люминальном А и люминальном В/HER2/neu-негативном подтипах РМЖ (p<0.05). МиРНК-221 является онкогеном и  регулирует два ключевых механизма в развитии опухоли: ингибирует супрессор p27 и способствует переходу ЭМП путем ингибирования E-кадгерина. По всей вероятности, миРНК-221 играет важную роль в ТНРМЖ [10]. Мы также установили, что уровень онкогенной миРНК-20a повышен почти в 7 раз в ТНРМЖ в сравнении с люминальными подтипами РМЖ (p<0.001). Таким образом, повышенная экспрессия онкогенных миРНК-221 и миРНК-20a является отличительной характеристикой ТНРМЖ и характеризует более агрессивное его течение. ROC-анализ позволил установить, что значение AUC для миРНК-221равно 0.772, что говорит о высокой значимости данного критерия в понимании различий между тройным негативным и люминальными подтипами РМЖ. Значение AUC для миРНК-20a равно 0.949, что делает его отличным маркером ТНРМЖ.

Заключение

Таким образом, полученные результаты позволили сформировать уникальный  профиль экспрессии миРНК для различных молекулярно-генетических подтипов РМЖ. Уровни экспрессии онкогенных миРНК-221 и миРНК-20a повышены в ТНРМЖ в сравнении с люминальным А и люминальным В/HER2/neu-негативным подтипами РМЖ, подтверждая характеристику ТНРМЖ, как наиболее агрессивного подтипа РМЖ. Для оценки значимости полученных различий проведен ROC анализ. Для миРНК-20a значение AUC равно 0.949. Таким образом, миРНК-20a является маркером ТНРМЖ в сравнении с люминальными подтипами РМЖ.

Рецензенты:

Антонеева И.И., д.м.н., заведующая гинекологическим отделением ГУЗ Областной клинический онкологический диспансер, врач высшей квалификационной категории, г. Ульяновск;

Демаков С.А., д.б.н., заведующий лабораторией хромосомной инженерией ИМКБ СО РАН, г. Новосибирск.