Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,936

EXPRESSION OF MICRORNAS IN MOLECULAR GENETIC BREAST CANCER SUBTYPES

1

• Authors
• Files
• Abstract
• Keywords
• References

Рак молочной железы (РМЖ) - злокачественное новообразование, развивающееся из клеток эпителия протоков и долек паренхимы молочной железы. В экономически развитых странах РМЖ - наиболее частая форма онкологического заболевания женщин. Самые высокие стандартизованные показатели заболеваемости РМЖ - 32 % всех случаев впервые диагностированных случаев рака у женщин, - зарегистрированы в США. В России в 2006 году распространенность РМЖ среди пациентов со злокачественными опухолями составила 17,8 %. Исследование венозной крови на опухолевые маркеры не является высокоспецифичным, его не используют для первичной диагностики РМЖ. Определение молекулярных опухолевых маркеров имеет прогностическое значение. В конце 90-х годов прошлого века в группе раков молочной железы были выделены опухоли, в которых не обнаруживаются рецепторы эстрогенов прогестерона и не наблюдается амплификация гена HER-2-nеu, - так называемый тройной негативный РМЖ [8]. На сегодня установлено, что примерно в 80 % случаев трижды негативный и базальный РМЖ совпадают. Но трижды негативный РМЖ включает в себя и некоторые особые гистологические типы.  Окрашивание на базальные кератины при этом считается недостаточно воспроизводимым для широкого использования. На практике клиницисты сталкиваются с ситуациями, когда люминальные подтипы РМЖ, характеризующиеся наиболее благоприятным течением,  ведут себя крайне агрессивно, при этом заболевание быстро прогрессирует и нередко заканчивается летальным исходом. И наоборот, наиболее агрессивный рак с тройным негативным фенотипом может протекать индолентно годами и не требовать адъювантных терапевтических методов лечения. Всё это требует поиска дополнительных молекулярно-генетических маркеров, позволяющих максимально индивидуализировать лечение больных РМЖ. Открытие молекул-ингибиторов синтеза белков на посттранскрипционном уровне -  микроРНК(миРНК) предоставило новые возможности в поиске специфических маркеров новообразований. Показано, что каждый тип опухолей человека обладает уникальным набором экспрессируемых миРНК, и опухоль специфические  миРНК в биологических тканях больного стабильны.  В связи с вышеизложенным, целью настоящего исследования явилось определение различий в экспрессии миРНК в опухолевой ткани инвазивной карциномы молочной железы по сравнению с нормальной тканью, а также анализ вариабельной экспрессии миРНК в молекулярно-генетических подтипах РМЖ. 

Материалы и методы. Материалом для исследования послужили 35 биоптатов опухолевой ткани и 35 биоптатов смежной условно нормальной ткани, соответственно, полученных в ходе оперативного радикального лечения 35 пациенток с диагнозом рак молочной железы в ГУЗ Областной клинический онкологический диспансер г. Ульяновска в 2014 году. Хирургическое лечение проводилось без предварительного химиолучевого воздействия.  Средний возраст пациенток составил 50±5,3 года. Стадия процесса была подтверждена патоморфологически после выполнения оперативного лечения и определялась согласно международной классификации TNM в 7 редакции от 2010 г. В 11 случаях была диагностирована I стадия заболевания, в 17 случаях - II стадия, в 7 случаях - III стадия. В 26 биоптатах опухолевой ткани молочной железы были выявлены люминальный  А и люминальный В/HER2/neu-негативный РМЖ; в  6 случаях был рак с тройным негативным фенотипом; в 1 биоптате был диагностирован люминальный/HER2/neu-позитивный рак и в 2 случаях - HER2/neu-позитивная карцинома. Ввиду малого числа наблюдений в двух последних подтипах в анализ включены пациенты с люминальным А и люминальный В/HER2/neu-негативным подтипами РМЖ. Для хранения и транспортировки операционного материала использовался раствор для стабилизации РНК RNA later, позволяющий выделять РНК из тканей и клеток без замораживания в жидком азоте. Выделение суммарного пула РНК проводили с помощью набора «Реал Бест экстракция 100» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск) в соответствии с инструкцией производителя. Обратная транскрипция была проведена при помощи специфичных праймеров к миРНК: миРНК-21, миРНК-221, миРНК-222, миРНК-155, миРНК-205, миРНК-20a, миРНК-125b, миРНК-146b, миРНК-200a. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием готовой реакционной смеси «Реал Бест Мастер микс ОТ» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск). Полученную кДНК, в объеме 3 мкл сразу использовали в качестве матрицы для проведения ПЦР. Измерение уровней экспрессии миРНК проводили методом ПЦР в реальном времени на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США) [2]. В качестве референсного гена использовали малую РНК U6. Реакцию ПЦР проводили в объеме 30 мкл с использованием готовой реакционной смеси «Реал Бест Мастер микс» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск) и раствора прямого и обратного праймеров (5 мкМ) и зонда (2.5 мкМ). Уровень экспрессии миРНК измерен при помощи метода ОТ - ПЦР в реальном времени. Статистическая обработка проводилась с применением  непараметрического U-критерия Манна - Уитни в программе Statistica 10.0. Для того чтобы  оценить значимость выявленных различий, проведена математическая  обработка методом построения ROC - кривой с использованием программного обеспечения IBM SPSS Statistics 21.

Результаты и обсуждение. Все миРНК разделены на онкогены и онкосупрессоры в зависимости от их роли в канцерогенезе РМЖ. МиРНК является онкогенной, если ее мишенью является онкосупрессорный ген, и наоборот, миРНК является онкосупрессорной, если её мишенью является онкоген. Стоит отметить, что одна миРНК может выступать как в роли онкогена, так и в роли онкосупрессора в зависимости от гена мишени, а также ткани, в которой она экспрессируется [1]. Проведен анализ экспрессии девяти миРНК: миРНК-21, -221, -222, -155, -205, -20a, -125b, -146b,  -200a в опухолевой ткани люминального А и люминального В/HER2/neu-негативного подтипов РМЖ в сравнении с прилежащей морфологически неизменной тканью. Были получены статистически значимые различия уровня экспрессии для семи  миРНК:  миРНК-21,-221,-222,-155,-205,-125b,-200a. Наиболее значимые различия в опухолевой ткани и в прилежащей морфологически неизмененной ткани (более  чем в 3 раза)  наблюдали  для двух онкогенных миРНК: миРНК - 155 и миРНК - 21 и двух онкосупрессорных миРНК: миРНК-205 и миРНК-125b (Табл.1). В ряде исследований было показано, что миРНК-21 является онкогеном и  ингибирует  опухолевые супрессоры  Pdcd4 и PTEN [9], а также коррелирует со стадией злокачественного процесса [3]. Одновременно было показано, что миРНК-155 также является онкогеном и участвует во множестве клеточных процессов, таких как регуляция пролиферации, миграция, вторжение, эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) и иммунный ответ [11,7]. Wang и соавт. показали, что в культуре клеток  РМЖ избыточная экспрессия миРНК-205 ингибирует пролиферацию, усиливает апоптоз, и уменьшается вторжение раковых клеток молочной железы, характеризуя миРНК-205 как онкосупрессор [13]. МиРНК-125b также является онкосупрессором для РМЖ и уменьшает пролиферативную активность  клеток [4,14]. Таким образом, миРНК-205 и миРНК-125b играют ключевую роль в прогрессировании и развитии рака молочной железы.  Так же стоит обратить внимание на  увеличение уровня экспрессии миРНК-200а почти в 2 раза в опухолевых образцах по сравнению с прилежащей морфологически неизмененной тканью (Табл.1). Семейство миРНК-200 регулирует ЭМП в различных типах рака, а также  коррелирует с наличием легочных метастазов [12,6].

Таблица 1

Изменение уровня экспрессии миРНК в опухолевой ткани люминального А и люминального В/HER2/neu-негативного подтипов РМЖ по сравнению с прилежащей морфологически неизмененной тканью

	миРНК
	155	21	200а	146b	205	125b	221	222	20a
Различие	3.68	3.66	1.78	1.02	7.84	7.78	1.71	1.56	1.17
Динамика	увеличение				понижение
P	0.000096	0.000980	0.082627	0.744125	0.000050	0.000020	0.006062	0.016630	0.212682

Примечания:  p<0.05 - различия статистически значимы между опухолевой тканью и прилежащей морфологически неизмененной тканью.

Проведен анализ экспрессии девяти миРНК: миРНК-21, -221, -222, -155, -205, -20a, -125b, -146b,  -200a в опухолевой ткани у пациенток с тройным негативным фенотипом РМЖ (ТНРМЖ) в сравнении с прилежащей морфологически неизменнной тканью. Были получены статистически значимые различия уровня экспрессии для трёх миРНК: миРНК-20a,-205,-125b (Табл.2). Во множестве исследований было показано, что миРНК-20a является онкогеном и сверхэкспрессируется при РМЖ [5]. Также  мы наблюдали значительное снижение (более чем в 3 раза) уровня экспрессии двух онкосупрессорных миРНК: миРНК-125b и миРНК-205 в опухолевой ткани в сравнении с  прилежащей морфологически неизмененной тканью. Как было описано выше миРНК-205 и миРНК-125b являются ключевыми участниками  канцерогенеза, и их пониженная экспрессия ассоциирована с неблагоприятным прогнозом РМЖ. Кроме того, мы наблюдали тенденцию к увеличению уровня экспрессии онкогенных миРНК -21 и миРНК-155 в опухолевой ткани тройного негативного РМЖ в сравнении с прилежащей морфологически неизменной тканью.

Таблица 2

Изменение уровня экспрессии миРНК в опухолевой ткани ТНРМЖ по сравнению с прилежащей морфологически неизмененной тканью

	миРНК
	155	21	20а	200a	146b	125b	205	222	221
Различие	7.01	3.23	3.16	2.52	1.97	10.45	3.50	1.86	1.12
Динамика	увеличение					понижение
P	0.111111	0.055555	0.031746	0.095238	0.547619	0.015873	0.007936	0.547619	0.841269

Примечания:  p<0.05 - различия статистически значимы между опухолевой тканью и прилежащей морфологически неизмененной тканью.

Проведено сравнение значений 2^-∆∆Ct выбранной группы миРНК между пациентами с люминальными подтипами РМЖ и пациентами с ТНРМЖ (Табл. 3).

Таблица 3

Изменение экспрессии миРНК в ТНРМЖ по сравнению с люминальными подтипами РМЖ.

миРНК	Различие	Динамика	P
миРНК  - 221	43.03	увеличение	0.0377779
миРНК  - 222	11.3	увеличение	0.2246853
миРНК  - 20a	6.42	увеличение	0.0001413
миРНК  - 200a	2.39	увеличение	0.0965447
миРНК  - 155	2.33	увеличение	0.3078420
миРНК  - 21	1.99	увеличение	0.3813739
миРНК  - 146b	1.63	увеличение	0.1185532
миРНК  - 125b	1.89	понижение	0.2641339
миРНК  - 205	1.01	понижение	0.8265458

Примечания:  p<0.05 - различия статистически значимы между опухолевой тканью и прилежащей морфологически неизмененной тканью

Мы установили, что уровень экспрессии онкогенной миРНК-221 в 43 раза выше в ТНРМЖ, чем в люминальном А и люминальном В/HER2/neu-негативном подтипах РМЖ (p<0.05). МиРНК-221 является онкогеном и  регулирует два ключевых механизма в развитии опухоли: ингибирует супрессор p27 и способствует переходу ЭМП путем ингибирования E-кадгерина. По всей вероятности, миРНК-221 играет важную роль в ТНРМЖ [10]. Мы также установили, что уровень онкогенной миРНК-20a повышен почти в 7 раз в ТНРМЖ в сравнении с люминальными подтипами РМЖ (p<0.001). Таким образом, повышенная экспрессия онкогенных миРНК-221 и миРНК-20a является отличительной характеристикой ТНРМЖ и характеризует более агрессивное его течение. ROC-анализ позволил установить, что значение AUC для миРНК-221равно 0.772, что говорит о высокой значимости данного критерия в понимании различий между тройным негативным и люминальными подтипами РМЖ. Значение AUC для миРНК-20a равно 0.949, что делает его отличным маркером ТНРМЖ.

Заключение

Таким образом, полученные результаты позволили сформировать уникальный  профиль экспрессии миРНК для различных молекулярно-генетических подтипов РМЖ. Уровни экспрессии онкогенных миРНК-221 и миРНК-20a повышены в ТНРМЖ в сравнении с люминальным А и люминальным В/HER2/neu-негативным подтипами РМЖ, подтверждая характеристику ТНРМЖ, как наиболее агрессивного подтипа РМЖ. Для оценки значимости полученных различий проведен ROC анализ. Для миРНК-20a значение AUC равно 0.949. Таким образом, миРНК-20a является маркером ТНРМЖ в сравнении с люминальными подтипами РМЖ.

Рецензенты:

Антонеева И.И., д.м.н., заведующая гинекологическим отделением ГУЗ Областной клинический онкологический диспансер, врач высшей квалификационной категории, г. Ульяновск;

Демаков С.А., д.б.н., заведующий лабораторией хромосомной инженерией ИМКБ СО РАН, г. Новосибирск.

---

Библиографическая ссылка

Титов С.Е., Родионов В.В., Веряскина Ю.А., Титов С.Е., Родионов В.В., Генинг Т.П., Абакумова Т.В., Кометова В.В., Торосян М.Х., Жимулев И.Ф., Колесников Н.Н. ЭКСПРЕССИЯ МИКРОРНК В МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОДТИПАХ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ // Современные проблемы науки и образования. 2015. № 5. ;
URL: https://science-education.ru/en/article/view?id=21656 (дата обращения: 02.06.2026).