Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МИКРОЦИРКУЛЯТОРНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ И ДИНАМИКИ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ СКАФФОЛДОВ НА ОСНОВЕ ПОЛИКАПРОЛАКТОНА И ПОЛИКАПРОЛАКТОНА С ГИДРОКСИАПАТИТОМ ПРИ СУБКУТАННОЙ ИМПЛАНТАЦИИ

Козадаев М.Н. 1 Иванов А.Н. 1 Пучиньян Д.М. 1 Норкин И.А. 1
1 Саратовский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии
Активное развитие тканеинженерных технологий представляет собой один из возможных путей решения актуальной проблемы регенерации и восстановления утраченных тканей. Ключевое значение в развитии технологий тканевой инженерии является разработка и создание 3-х мерных скаффолдов – матриц, которые могут выступать в качестве субстрата для заселения клетками, стимулируя процесс регенерации. В данной экспериментальной работе представлены результаты сравнительного анализа микроциркуляторных изменений и динамики клеточных популяций скаффолдов на основе поликапролактона (ПКЛ) и матриц на основе ПКЛ с гидроксиапатитом (ГА). Результаты исследования позволяют сделать заключение о том, что при подкожной имплантации оба скаффолда способны к интеграции в соединительную ткань в условиях in vivo, активно заселяются соединительнотканными элементами и васкуляризуются, на фоне незначительных реактивных изменений. Однако при подкожной имплантации матрицы на основе ПКЛ и ГА отличаются меньшей скоростью заселения соединительнотканными элементами по сравнению с ПКЛ-скаффолдами.
скаффолд
поликапролактон
гидроксиапатит
биосовместимость
1. Иванов А.Н., Федонников А.С., Норкин И.А. Пучиньян Д.М. Коррекция микроциркуляторных нарушений в стратегиях менеджмента остеоартрита и остеохондропатий // Российский медицинский журнал. –2015. – Т. 21, №1. – С. 18-23.
2. Иванов А.Н., Норкин И.А., Пучиньян Д.М. Возможности и перспективы использования скаффолд-технологий для регенерации костной ткани // Цитология. – 2014. – Т. 56, № 8. – С. 543-548.
3. Киреев С.И. Исследование реактивности организма при хирургическом лечении переломов костей верхней конечности // Вестник новых медицинских технологий.– 2009. – Т. 16, № 1. – С.122-123.
4. Новочадов В.В. Проблема управления клеточным заселением и ремоделированием тканеинженерных матриц для восстановления суставного хряща // Вестник Волгоградского государственного университета. – 2013.– Т. 1, № 5. – С.19-28.
5. A pilot study of the use of an osteochondral scaffold plug for cartilage repair in the knee and how to deal with early clinical failures / A.A. Dhollander, K. Liekens, K.F. Almqvist et al. // Arthroscopy.– 2012.– № 28. – P. 225-233.
6. Comparison of Cellular Proliferation on Dense and Porous PCL Scaffolds / H. Şaşmazel, M. Gümüşderelioğlu, A.Gürpınar, M.A. Onur // Bio-Medical Materials and Engineering.– 2008.– Vol. 18, №3. – P. 119-128.
7. Erisken C., Kalyon D.M., Wang H. Functionally graded electrospun polycaprolactone and beta-tricalcium phosphate nanocomposites for tissue engineering applications // Biomaterials. – 2008. – Vol. 29, № 30. – P. 4065-4073.
8. Poly-epsilon-caprolactone gel hybrid scaffolds for cartilage tissue engineering / J.C. Schagemann, H.W. Chung, Mrosek E.H., J.J. Stone et al //. Biomed Mater Res A.– 2010.– Vol. 93, №2. – P. 454-463.
9. Response of engineered cartilage tissue to biochemical agents as studied by proton magnetic resonance microscopy / K. Potter, J.J. Butler, W.E. Horton, R.G.S. Spencer // Arthritis Rheum.– 2000.– № 43. – P. 1580-1590.
10. Robocasting nanocomposite scaffolds of poly (caprolactone) hydroxyapatite incorporating modified carbon nanotubes for hard tissue reconstruction / B. Dorj, J.E. Won, J.H. Kim et al. // J Biomed Mater Res A.– 2013.– Vol. 101, № 6. – P. 1670-1681.

Для создания матриц, применяемых в тканевой инженерии, используется обширный спектр материалов, имеющих природное и искусственное происхождение, а также их комбинации, позволяющие моделировать механические свойства скаффолдов и параметры биодеградации [5]. Одним из полимеров, применяемых для создания скаффолдов, является поликапролактон (ПКЛ), который не обладает цитотоксическими эффектами и способен к биодеградации в организме [2, 9]. Включенный в состав матрицы на основе ПКЛ гидроксиапатит (ГА), являющийся кристаллохимическим аналогом минеральной составляющей костной ткани и обладающий остеокондуктивностью, может найти широкое применение в клинической практике [2, 4]. Ранее проведенные исследования ПКЛ-скаффолдов в условиях in vitroпродемонстрировали хорошую адгезию и пролиферацию клеток, культивируемых на подобных матрицах [6, 8]. Основными требованиями, предъявляемыми к скаффолдам, являются их биосовместимость и способность, заселяясь клеточными элементами, со временем замещаться на собственные ткани организма [4].

Межгосударственный стандарт для изделий медицинского назначения ISO (ГОСТ 10993-1-2011) рекомендует для выявления местного патогенного действия материалов на живую ткань обязательное применение имплантационных тестов, в том числе и субкутанных. Известно, что система микроциркуляции динамически изменяется при сдвигах гомеостаза [1, 3], отражая функциональное состояние ткани. Поэтому для оценки местной воспалительной реакции на имплантацию различных скаффолдов, помимо обязательного морфологического анализа биоптатов зоны имплантации [7], перспективным, на наш взгляд, является использование параметров тканевой перфузии.

В связи с этим целью работы являлся сравнительный анализ воспалительных изменений микроциркуляции и динамики заселения клетками оригинальных скаффолдов на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА в условиях in vivo.

Материалы и методы

Экспериментальная работа была проведена в соответствии с Хельсинской декларацией о гуманном отношении к животным. За 5 мин до проведения манипуляций крысам вводили внутримышечно комбинацию ксилазина (Interchemie, Нидерланды) в дозе 1 мг/кг и золетила (Virbac Sante Animale, Франция) в дозе 0,1 мл/кг для достижения наркоза.

Оригинальные отечественные скаффолды на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА были разработаны и изготовлены лабораторией «Материалы специального назначения» Саратовского государственного университета имени Н.Г. Чернышевского.

Эксперимент проведен на 60 белых нелинейных крысах самцах, разделенных на 2 экспериментальные группы: первой группе крыс имплантировали оригинальный скаффолд на основе ПКЛ (100%), а второй группе животных - скаффолд на основе ПКЛ (95%) и ГА (5%). Имплантация матриц была проведена по методике, аналогичной B Dorj et al. [10]. Скаффолд в форме диска диаметром 15 мм, толщиной 0,1 мм имплантировали подкожно в межлопаточную область животного. Крыс выводили из эксперимента путем декапитации на 7, 14 и 21 сутки по 10 особей из каждой группы.

Для морфологического сравнительного анализа оригинальных скаффолдов проводили забор мягких тканей зоны имплантации, совместно с матрицей, единым блоком. Материал для морфологического исследования фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина (ООО «Биовитрум», Россия), обезвоживали в спиртах восходящей крепости, после чего заливали в парафин. Срезы толщиной 5-10 мкм окрашивали гематоксилином Майера (ООО «Биовитрум», Россия) и эозином (ООО «Биовитрум», Россия). Для покрытия срезов применяли Bio-Monht и Bio-Clear («Bio Optica», Италия). С помощью микроскопа AxioImager Z2 (производство CarlZeiss, Германия) оценивали и сравнивали между собой структуру, клеточный состав, состояние микроциркуляторного русла окружающих матрицы мягких тканей, динамику заселения скаффолдов клеточными элементами и состав клеточных популяций матриц.

Микроциркуляцию оценивали методом лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ). Проводилось определение, а затем сравнительный анализ показателей перфузии в перфузионных единицах, а также нормированных амплитуд нейрогенных, миогенных и эндотелиальных осцилляций микрокровотока с помощью спектрального вейвлет-анализа. Регистрацию ЛДФ-грамм осуществляли на 7, 14 и 21 день эксперимента над областью имплантации матриц. Для контроля использовали ЛДФ-граммы, зарегистрированные у крыс до имплантации.

Статистическую обработку данных осуществляли средствами программы Statistica 10. Большинство полученных данных не соответствовали закону нормального распределения, поэтому для сравнения показателей использовали U-критерий Мана-Уитни. Значимыми считали различия при p <0,05.

Результаты

В результате проведенного исследования установлено, что на 7-е сутки эксперимента показатель перфузии кожи статистически значимо выше над областью имплантации скаффолда на основе ПКЛ, чем матрицы на основе ПКЛ и ГА (табл. 1). На 7 сутки после имплантации матриц на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА изменения нормированных амплитуд колебаний в эндотелиальном, нейрогенном и миогенном диапазонах не имеют статистически значимых различий между собой (табл. 2), а также по сравнению с контролем (p>0,005).

В ходе сравнения морфологической картины установлено, что через 7 суток после имплантации скаффолдов на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА воспалительные изменения проявляются полнокровием сосудов микроциркуляторного русла, умеренным отеком подкожной клетчатки, а также инфильтрацией ее единичными лейкоцитами как в одной, так и в другой группах животных. При этом в обеих экспериментальных группах заселение скаффолда элементами соединительной ткани наиболее ярко выражено на границах матриц с тканями.

Таблица 1

Изменения перфузии кожи у животных при подкожной имплантации скаффолдов на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА

Группа

ПКЛ-скаффолд

ПКЛ-ГА-скаффолд

После имплантации

7 сутки (n=10)

12,9 (12,5; 13,4)

11,4 (11,0; 13,2)

p = 0,021600

14 сутки (n=10)

12,1 (11,1; 12,3)

12,9 (12,7; 13,4)

p = 0,144914

21 сутки (n=10)

11,5 (11.3; 11.9)

10.70 (10,60; 11,2)

p = 0,001299

Примечания: В каждом случае приведены медиана, верхний и нижний квартили (25%; 75%), p - показатель достоверности по отношению к данным, полученным при имплантации ПКЛ-скаффолдов.

Таблица 2

Сравнительная характеристика колебаний микрокровотока кожи при подкожной имплантации матриц на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА

Показатели

Группа

Нормированная амплитуда колебаний, отн. ед

эндотелиальных

нейрогенных

миогенных

После имплантации

7 сутки

ПКЛ (n=10)

19,64 (17,78; 21,07)

6,13 (5,08; 8,43)

7,01 (5,92; 8,78)

ПКЛ + ГА (n=10)

17,58 (15,67; 18,56)

p = 1,000000

7,51 (6,08; 8,24)

p = 0,645898

7,84 (6,48; 8,54)

p = 0,645898

14 сутки

ПКЛ (n=10)

21,0 (19,55; 23,34)

6,25 (4,89; 8,38)

7,63 (4,98; 8,07)

ПКЛ + ГА (n=10)

15,24 (6,30; 21,76)

p = 1,000000

4,74 (3,92; 9,70)

p = 0,627029

7,15 (4,75; 7,55)

p = 0,144914

21 сутки

ПКЛ (n=10)

17,80 (14,23; 20,77)

5,90 (4,04; 7,17)

4,75 (4,61;6,14)

ПКЛ + ГА (n=10)

20,80 (20,62; 21,91)

p = 0,021600

5,84 (4,73; 6,63)

p = 1,000000

6,02 (5,46; 6,35)

p = 0,358129

Примечания: те же, что и в табл.1.

В структуре обеих сравниваемых матриц через 7 суток после имплантации присутствуют единичные лейкоциты на фоне преобладающих фибробластических элементов. Статистически значимых различий количества нейтрофильных лейкоцитов, моноцитов и макрофагов, а также лимфоцитов между группами не выявлено (табл. 3).

Таблица 3

Динамика состава клеточных популяций при подкожной имплантации матриц на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА (число клеток на одно поле при увеличении х400)

Клетки

Группы

животных

Время после имплантации

7 суток

14 суток

21 сутки

Фибробласты

ПКЛ (n=10)

59 (53; 70)

80 (72; 88)

81 (69; 85)

ПКЛ + ГА (n=10)

48 (39; 54)

p = 0,168079

64 (53; 66)

p = 0,021600

61 (50; 72)

p = 0,168079

Фиброциты

ПКЛ (n=10)

16 (14; 19)

40 (35; 52)

61.5 (53; 66)

ПКЛ + ГА (n=10)

11 (9; 14)

p = 0,168079

32 (27; 42)

p = 0,021600

41 (38; 48)

p = 0,021600

Нейтрофилы

ПКЛ (n=10)

7 (4; 9)

5 (4; 7)

5 (4; 6)

ПКЛ + ГА (n=10)

6 (4; 8)

p = 1,000000

6 (4; 7)

p = 0,358129

5 (3; 7)

p = 0,645898

Моноциты и макрофаги

ПКЛ (n=10)

8.5 (5; 11)

8,5 (3; 15)

8 (5; 10)

ПКЛ + ГА (n=10)

7 (5; 12)

p = 0,645898

11 (7; 13)

p1 = 0,645898

10 (6; 12)

p = 0,066082

Лимфоциты

ПКЛ (n=10)

9 (6; 12)

10 (8; 13)

6 (2; 7)

ПКЛ + ГА (n=10)

12 (7; 13)

p = 1,000000

11 (7; 15)

p = 0,168079

6 (3; 8)

p = 1,000000

Примечания: те же, что и в табл. 1.

Таким образом, данные полученные в ходе морфологического исследования, соответствуют динамике показателей микроциркуляции и свидетельствуют об умеренной степени выраженности реактивных реакций в обеих группах животных.

На 14-е сутки после имплантации скаффолдов не выявлено статистически значимых различий перфузионного показателя при сравнении опытных групп животных между собой (табл. 1). Нормированные амплитуды эндотелиальных, миогенных и нейрогенных колебаний у животных сравнимых групп также не имеют значимых различий спустя 14 суток после имплантации (табл. 2).

При сравнении морфологической картины мягких тканей зоны имплантации скаффолдов на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА на 14-е сутки эксперимента обнаружено, что у животных данных групп сохраняются незначительные реактивные изменения, проявляющиеся полнокровием кровеносных сосудов, степень выраженности которого не зависит от вида используемой матрицы. При имплантации как скаффолда на основе ПКЛ, так и матрицы, содержащей ГА, лейкоцитарная инфильтрация перифокальной зоны представлена единичными нейтрофилами и лимфоцитами.

На 14-е сутки после имплантации увеличивается число фибробластических элементов в структуре матриц, а клеточные элементы равномерно распределяются по структуре имплантатов. При этом количество фиброцитов и фибробластов статистически значимо выше в структуре скаффолда на основе ПКЛ по сравнению со скаффолдом на основе ПКЛ и ГА (табл. 3). В составе клеточной популяции обеих изучаемых матриц на 14 сутки после имплантации присутствуют единичные лейкоциты: нейтрофилы, макрофаги, лимфоциты, количество которых не имеет статистически значимых различий между группами (табл. 3). Оба типа матриц на 14-е сутки после имплантации содержат сосуды. Различий степени выраженности васкуляризации в зависимости от вида скаффолда не выявлено.

Таким образом, данные ЛДФ-грамм при имплантации скаффолдов на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА через 14 дней не имеют статистически значимых различий, но заселение матрицы на основе ПКЛ клетками фибропластического ряда на 14-е сутки исследования протекает интенсивнее по сравнению со скаффолдом на основе ПКЛ и ГА.

На 21-е сутки перфузионный показатель и нормированные амплитуды нейрогенных и миогенных колебаний микрокровотока кожи у животных с имплантацией изучаемых типов скаффолдов не имеют статистически значимых различий (табл. 1, 2). При этом нормированные амплитуды эндотелиальных колебаний при имплантации матрицы на основе ПКЛ и ГА статистически значимо превышают таковые в группе животных, которым проводилась имплантация ПКЛ-скаффолда (табл. 2). Однако, значения нормированных амплитуд эндотелиальных колебаний в группах животных, которым проводилась имплантация матриц на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА, на 21-е сутки эксперимента находятся в пределах вариабельности до имплантационных значений (р=0,561276 и р=0,183098 соответственно).

На 21 день реактивные изменения тканей перифокальной зоны не выявлены. При использовании как одного, так и другого вида матриц, отмечается умеренное кровенаполнение сосудов перифокальной зоны. Изучаемые матрицы равномерно заселены клетками фибробластического ряда и васкуляризованы. Однако, количество фиброцитов в ПКЛ-скаффолдах статистически значимо выше, чем в матрицах на основе ПКЛ с ГА, что отражает различную интенсивность их заселения (табл. 3).

В составе клеточных популяций матриц на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА на 21 сутки после имплантации присутствуют единичные лейкоциты: нейтрофилы, макрофаги, лимфоциты, количество которых не имеет статистически значимых различий между группами (табл. 3). На 21-е сутки после имплантации происходит истончение волокон в обеих изучаемых матрицах, что свидетельствует о начавшейся биодеградации.

Таким образом, при имплантации скаффолдов на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА изменения микроциркуляции кожи слабо выражены в обеих группах и не имеют между собой значимых отличий, наиболее ярко проявляясь на 7-е сутки и полностью исчезая на 21-е. Изменения показателей ЛДФ-грамм полностью соответствуют динамике морфологической картины, свидетельствующей о том, что наибольшие реактивные изменения окружающих тканей отмечаются на 7-е сутки и полностью купируются к 21-м суткам как при имплантации ПКЛ-скаффолда, так и матрицы на основе ПКЛ с ГА.

Выводы

При сравнительном анализе скаффолдов на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА установлено, что изменения микроциркуляции кожи слабо выражены в обеих группах и не имеют между собой значимых отличий. Изменения динамики перфузии кожи соответствуют динамике морфологической картины в обеих экспериментальных группах. Заселение ПКЛ-скаффолдов и скаффолдав на основе ПКЛ с ГА клетками соединительной ткани протекает активно в период с 7-х по 21 сутки эксперимента, но интенсивность заселения клеточными элементами выше при имплантации матрицы на основе ПКЛ. Установлено также, что спустя 21-е сутки с момента имплантации скаффолдов обоего типа появляются первые признаки их биодеградации

Таким образом, отечественные скаффолды как на основе ПКЛ (100%), так и ПКЛ (95%) с ГА (5%) способны к интеграции в соединительную ткань в условиях in vivo. Активное заселение исследуемых матриц соединительнотканными элементами, васкуляризация на фоне незначительных реактивных изменений при подкожной имплантации убедительно демонстрирует их биосовместимость. Однако при подкожной имплантации матриц на основе ПКЛ с ГА скорость их заселения соединительнотканными элементами меньше, чем при использовании ПКЛ-скаффолдов.

Рецензенты:

Киреев С.И., д.м.н., профессор кафедры травматологии и ортопедии, ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России, г. Саратов;

Антипова О.Н., д.м.н., профессор кафедры нормальной физиологии им. И.А. Чуевского, ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России, г. Саратов.


Библиографическая ссылка

Козадаев М.Н., Иванов А.Н., Пучиньян Д.М., Норкин И.А. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МИКРОЦИРКУЛЯТОРНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ И ДИНАМИКИ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ СКАФФОЛДОВ НА ОСНОВЕ ПОЛИКАПРОЛАКТОНА И ПОЛИКАПРОЛАКТОНА С ГИДРОКСИАПАТИТОМ ПРИ СУБКУТАННОЙ ИМПЛАНТАЦИИ // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 5. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=21447 (дата обращения: 17.09.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074