Для создания матриц, применяемых в тканевой инженерии, используется обширный спектр материалов, имеющих природное и искусственное происхождение, а также их комбинации, позволяющие моделировать механические свойства скаффолдов и параметры биодеградации [5]. Одним из полимеров, применяемых для создания скаффолдов, является поликапролактон (ПКЛ), который не обладает цитотоксическими эффектами и способен к биодеградации в организме [2, 9]. Включенный в состав матрицы на основе ПКЛ гидроксиапатит (ГА), являющийся кристаллохимическим аналогом минеральной составляющей костной ткани и обладающий остеокондуктивностью, может найти широкое применение в клинической практике [2, 4]. Ранее проведенные исследования ПКЛ-скаффолдов в условиях in vitroпродемонстрировали хорошую адгезию и пролиферацию клеток, культивируемых на подобных матрицах [6, 8]. Основными требованиями, предъявляемыми к скаффолдам, являются их биосовместимость и способность, заселяясь клеточными элементами, со временем замещаться на собственные ткани организма [4].
Межгосударственный стандарт для изделий медицинского назначения ISO (ГОСТ 10993-1-2011) рекомендует для выявления местного патогенного действия материалов на живую ткань обязательное применение имплантационных тестов, в том числе и субкутанных. Известно, что система микроциркуляции динамически изменяется при сдвигах гомеостаза [1, 3], отражая функциональное состояние ткани. Поэтому для оценки местной воспалительной реакции на имплантацию различных скаффолдов, помимо обязательного морфологического анализа биоптатов зоны имплантации [7], перспективным, на наш взгляд, является использование параметров тканевой перфузии.
В связи с этим целью работы являлся сравнительный анализ воспалительных изменений микроциркуляции и динамики заселения клетками оригинальных скаффолдов на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА в условиях in vivo.
Материалы и методы
Экспериментальная работа была проведена в соответствии с Хельсинской декларацией о гуманном отношении к животным. За 5 мин до проведения манипуляций крысам вводили внутримышечно комбинацию ксилазина (Interchemie, Нидерланды) в дозе 1 мг/кг и золетила (Virbac Sante Animale, Франция) в дозе 0,1 мл/кг для достижения наркоза.
Оригинальные отечественные скаффолды на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА были разработаны и изготовлены лабораторией «Материалы специального назначения» Саратовского государственного университета имени Н.Г. Чернышевского.
Эксперимент проведен на 60 белых нелинейных крысах самцах, разделенных на 2 экспериментальные группы: первой группе крыс имплантировали оригинальный скаффолд на основе ПКЛ (100%), а второй группе животных - скаффолд на основе ПКЛ (95%) и ГА (5%). Имплантация матриц была проведена по методике, аналогичной B Dorj et al. [10]. Скаффолд в форме диска диаметром 15 мм, толщиной 0,1 мм имплантировали подкожно в межлопаточную область животного. Крыс выводили из эксперимента путем декапитации на 7, 14 и 21 сутки по 10 особей из каждой группы.
Для морфологического сравнительного анализа оригинальных скаффолдов проводили забор мягких тканей зоны имплантации, совместно с матрицей, единым блоком. Материал для морфологического исследования фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина (ООО «Биовитрум», Россия), обезвоживали в спиртах восходящей крепости, после чего заливали в парафин. Срезы толщиной 5-10 мкм окрашивали гематоксилином Майера (ООО «Биовитрум», Россия) и эозином (ООО «Биовитрум», Россия). Для покрытия срезов применяли Bio-Monht и Bio-Clear («Bio Optica», Италия). С помощью микроскопа AxioImager Z2 (производство CarlZeiss, Германия) оценивали и сравнивали между собой структуру, клеточный состав, состояние микроциркуляторного русла окружающих матрицы мягких тканей, динамику заселения скаффолдов клеточными элементами и состав клеточных популяций матриц.
Микроциркуляцию оценивали методом лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ). Проводилось определение, а затем сравнительный анализ показателей перфузии в перфузионных единицах, а также нормированных амплитуд нейрогенных, миогенных и эндотелиальных осцилляций микрокровотока с помощью спектрального вейвлет-анализа. Регистрацию ЛДФ-грамм осуществляли на 7, 14 и 21 день эксперимента над областью имплантации матриц. Для контроля использовали ЛДФ-граммы, зарегистрированные у крыс до имплантации.
Статистическую обработку данных осуществляли средствами программы Statistica 10. Большинство полученных данных не соответствовали закону нормального распределения, поэтому для сравнения показателей использовали U-критерий Мана-Уитни. Значимыми считали различия при p <0,05.
Результаты
В результате проведенного исследования установлено, что на 7-е сутки эксперимента показатель перфузии кожи статистически значимо выше над областью имплантации скаффолда на основе ПКЛ, чем матрицы на основе ПКЛ и ГА (табл. 1). На 7 сутки после имплантации матриц на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА изменения нормированных амплитуд колебаний в эндотелиальном, нейрогенном и миогенном диапазонах не имеют статистически значимых различий между собой (табл. 2), а также по сравнению с контролем (p>0,005).
В ходе сравнения морфологической картины установлено, что через 7 суток после имплантации скаффолдов на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА воспалительные изменения проявляются полнокровием сосудов микроциркуляторного русла, умеренным отеком подкожной клетчатки, а также инфильтрацией ее единичными лейкоцитами как в одной, так и в другой группах животных. При этом в обеих экспериментальных группах заселение скаффолда элементами соединительной ткани наиболее ярко выражено на границах матриц с тканями.
Таблица 1
Изменения перфузии кожи у животных при подкожной имплантации скаффолдов на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА
Группа |
ПКЛ-скаффолд |
ПКЛ-ГА-скаффолд |
|
После имплантации |
7 сутки (n=10) |
12,9 (12,5; 13,4) |
11,4 (11,0; 13,2) p = 0,021600 |
14 сутки (n=10) |
12,1 (11,1; 12,3) |
12,9 (12,7; 13,4) p = 0,144914 |
|
21 сутки (n=10) |
11,5 (11.3; 11.9) |
10.70 (10,60; 11,2) p = 0,001299 |
Примечания: В каждом случае приведены медиана, верхний и нижний квартили (25%; 75%), p - показатель достоверности по отношению к данным, полученным при имплантации ПКЛ-скаффолдов.
Таблица 2
Сравнительная характеристика колебаний микрокровотока кожи при подкожной имплантации матриц на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА
Показатели Группа |
Нормированная амплитуда колебаний, отн. ед |
||||
эндотелиальных |
нейрогенных |
миогенных |
|||
После имплантации |
7 сутки |
ПКЛ (n=10) |
19,64 (17,78; 21,07) |
6,13 (5,08; 8,43) |
7,01 (5,92; 8,78) |
ПКЛ + ГА (n=10) |
17,58 (15,67; 18,56) p = 1,000000 |
7,51 (6,08; 8,24) p = 0,645898 |
7,84 (6,48; 8,54) p = 0,645898 |
||
14 сутки |
ПКЛ (n=10) |
21,0 (19,55; 23,34) |
6,25 (4,89; 8,38) |
7,63 (4,98; 8,07) |
|
ПКЛ + ГА (n=10) |
15,24 (6,30; 21,76) p = 1,000000 |
4,74 (3,92; 9,70) p = 0,627029 |
7,15 (4,75; 7,55) p = 0,144914 |
||
21 сутки |
ПКЛ (n=10) |
17,80 (14,23; 20,77) |
5,90 (4,04; 7,17) |
4,75 (4,61;6,14) |
|
ПКЛ + ГА (n=10) |
20,80 (20,62; 21,91) p = 0,021600 |
5,84 (4,73; 6,63) p = 1,000000 |
6,02 (5,46; 6,35) p = 0,358129 |
Примечания: те же, что и в табл.1.
В структуре обеих сравниваемых матриц через 7 суток после имплантации присутствуют единичные лейкоциты на фоне преобладающих фибробластических элементов. Статистически значимых различий количества нейтрофильных лейкоцитов, моноцитов и макрофагов, а также лимфоцитов между группами не выявлено (табл. 3).
Таблица 3
Динамика состава клеточных популяций при подкожной имплантации матриц на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА (число клеток на одно поле при увеличении х400)
Клетки |
Группы животных |
Время после имплантации |
||
7 суток |
14 суток |
21 сутки |
||
Фибробласты |
ПКЛ (n=10) |
59 (53; 70) |
80 (72; 88) |
81 (69; 85) |
ПКЛ + ГА (n=10) |
48 (39; 54) p = 0,168079 |
64 (53; 66) p = 0,021600 |
61 (50; 72) p = 0,168079 |
|
Фиброциты |
ПКЛ (n=10) |
16 (14; 19) |
40 (35; 52) |
61.5 (53; 66) |
ПКЛ + ГА (n=10) |
11 (9; 14) p = 0,168079 |
32 (27; 42) p = 0,021600 |
41 (38; 48) p = 0,021600 |
|
Нейтрофилы |
ПКЛ (n=10) |
7 (4; 9) |
5 (4; 7) |
5 (4; 6) |
ПКЛ + ГА (n=10) |
6 (4; 8) p = 1,000000 |
6 (4; 7) p = 0,358129 |
5 (3; 7) p = 0,645898 |
|
Моноциты и макрофаги |
ПКЛ (n=10) |
8.5 (5; 11) |
8,5 (3; 15) |
8 (5; 10) |
ПКЛ + ГА (n=10) |
7 (5; 12) p = 0,645898 |
11 (7; 13) p1 = 0,645898 |
10 (6; 12) p = 0,066082 |
|
Лимфоциты |
ПКЛ (n=10) |
9 (6; 12) |
10 (8; 13) |
6 (2; 7) |
ПКЛ + ГА (n=10) |
12 (7; 13) p = 1,000000 |
11 (7; 15) p = 0,168079 |
6 (3; 8) p = 1,000000 |
Примечания: те же, что и в табл. 1.
Таким образом, данные полученные в ходе морфологического исследования, соответствуют динамике показателей микроциркуляции и свидетельствуют об умеренной степени выраженности реактивных реакций в обеих группах животных.
На 14-е сутки после имплантации скаффолдов не выявлено статистически значимых различий перфузионного показателя при сравнении опытных групп животных между собой (табл. 1). Нормированные амплитуды эндотелиальных, миогенных и нейрогенных колебаний у животных сравнимых групп также не имеют значимых различий спустя 14 суток после имплантации (табл. 2).
При сравнении морфологической картины мягких тканей зоны имплантации скаффолдов на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА на 14-е сутки эксперимента обнаружено, что у животных данных групп сохраняются незначительные реактивные изменения, проявляющиеся полнокровием кровеносных сосудов, степень выраженности которого не зависит от вида используемой матрицы. При имплантации как скаффолда на основе ПКЛ, так и матрицы, содержащей ГА, лейкоцитарная инфильтрация перифокальной зоны представлена единичными нейтрофилами и лимфоцитами.
На 14-е сутки после имплантации увеличивается число фибробластических элементов в структуре матриц, а клеточные элементы равномерно распределяются по структуре имплантатов. При этом количество фиброцитов и фибробластов статистически значимо выше в структуре скаффолда на основе ПКЛ по сравнению со скаффолдом на основе ПКЛ и ГА (табл. 3). В составе клеточной популяции обеих изучаемых матриц на 14 сутки после имплантации присутствуют единичные лейкоциты: нейтрофилы, макрофаги, лимфоциты, количество которых не имеет статистически значимых различий между группами (табл. 3). Оба типа матриц на 14-е сутки после имплантации содержат сосуды. Различий степени выраженности васкуляризации в зависимости от вида скаффолда не выявлено.
Таким образом, данные ЛДФ-грамм при имплантации скаффолдов на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА через 14 дней не имеют статистически значимых различий, но заселение матрицы на основе ПКЛ клетками фибропластического ряда на 14-е сутки исследования протекает интенсивнее по сравнению со скаффолдом на основе ПКЛ и ГА.
На 21-е сутки перфузионный показатель и нормированные амплитуды нейрогенных и миогенных колебаний микрокровотока кожи у животных с имплантацией изучаемых типов скаффолдов не имеют статистически значимых различий (табл. 1, 2). При этом нормированные амплитуды эндотелиальных колебаний при имплантации матрицы на основе ПКЛ и ГА статистически значимо превышают таковые в группе животных, которым проводилась имплантация ПКЛ-скаффолда (табл. 2). Однако, значения нормированных амплитуд эндотелиальных колебаний в группах животных, которым проводилась имплантация матриц на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА, на 21-е сутки эксперимента находятся в пределах вариабельности до имплантационных значений (р=0,561276 и р=0,183098 соответственно).
На 21 день реактивные изменения тканей перифокальной зоны не выявлены. При использовании как одного, так и другого вида матриц, отмечается умеренное кровенаполнение сосудов перифокальной зоны. Изучаемые матрицы равномерно заселены клетками фибробластического ряда и васкуляризованы. Однако, количество фиброцитов в ПКЛ-скаффолдах статистически значимо выше, чем в матрицах на основе ПКЛ с ГА, что отражает различную интенсивность их заселения (табл. 3).
В составе клеточных популяций матриц на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА на 21 сутки после имплантации присутствуют единичные лейкоциты: нейтрофилы, макрофаги, лимфоциты, количество которых не имеет статистически значимых различий между группами (табл. 3). На 21-е сутки после имплантации происходит истончение волокон в обеих изучаемых матрицах, что свидетельствует о начавшейся биодеградации.
Таким образом, при имплантации скаффолдов на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА изменения микроциркуляции кожи слабо выражены в обеих группах и не имеют между собой значимых отличий, наиболее ярко проявляясь на 7-е сутки и полностью исчезая на 21-е. Изменения показателей ЛДФ-грамм полностью соответствуют динамике морфологической картины, свидетельствующей о том, что наибольшие реактивные изменения окружающих тканей отмечаются на 7-е сутки и полностью купируются к 21-м суткам как при имплантации ПКЛ-скаффолда, так и матрицы на основе ПКЛ с ГА.
Выводы
При сравнительном анализе скаффолдов на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА установлено, что изменения микроциркуляции кожи слабо выражены в обеих группах и не имеют между собой значимых отличий. Изменения динамики перфузии кожи соответствуют динамике морфологической картины в обеих экспериментальных группах. Заселение ПКЛ-скаффолдов и скаффолдав на основе ПКЛ с ГА клетками соединительной ткани протекает активно в период с 7-х по 21 сутки эксперимента, но интенсивность заселения клеточными элементами выше при имплантации матрицы на основе ПКЛ. Установлено также, что спустя 21-е сутки с момента имплантации скаффолдов обоего типа появляются первые признаки их биодеградации
Таким образом, отечественные скаффолды как на основе ПКЛ (100%), так и ПКЛ (95%) с ГА (5%) способны к интеграции в соединительную ткань в условиях in vivo. Активное заселение исследуемых матриц соединительнотканными элементами, васкуляризация на фоне незначительных реактивных изменений при подкожной имплантации убедительно демонстрирует их биосовместимость. Однако при подкожной имплантации матриц на основе ПКЛ с ГА скорость их заселения соединительнотканными элементами меньше, чем при использовании ПКЛ-скаффолдов.
Рецензенты:
Киреев С.И., д.м.н., профессор кафедры травматологии и ортопедии, ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России, г. Саратов;
Антипова О.Н., д.м.н., профессор кафедры нормальной физиологии им. И.А. Чуевского, ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России, г. Саратов.