Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

ЭКПЕРИМЕНТАЛЬНО-ЛАБОРАТОРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТОДОВ КОНСЕРВИРОВАНИЯ БИОТРАНСПЛАНТАТОВ

Аванесян Р.А. 1 Ивлева А.Д. 1
1 ГБОУ ВПО «Ставропольский государственный медицинский университет Минздрава России»
Статья посвящена изучению методов консервирования биотрансплантатов и их влияния на органы и ткани с помощью лабораторных экспериментов на животных. Было проведено исследование иммунологической активности гомологичной кожи при воздействии на нее различными химическими и физическими факторами, нашедшими применение при консервировании тканей. Животных (кроликов) сенсибилизировали подкожным введением 1 мл экстракта кожи. Через 15–16 суток им вводили разрешающую дозу того же экстракта в количестве 9–10 мл. Таким способом проведено сравнение воздействия различных консервирующих сред на антигенную активность тканей. По такой же методике проведено сравнение влияния 0,25-, 0,5-, 0,75-, 1-, 1,5- и 3%-ного растворов формальдегида при экспозиции от 12 ч до 10 суток на иммунологическую активность гомологичной кожи. Результаты опытов показали, что изменение иммунологической активности гомологичной кожи при консервировании в растворах формалина слабых концентраций находится в прямо пропорциональной зависимости от процентного содержания формалина и экспозиции в консервирующем растворе. Другие результаты испытаний физических свойств нормальной и консервированной костной ткани показали, что механическая прочность консервированной костной ткани уменьшается, причем это более заметно при использовании в качестве консерванта 0,25%-ного формалина. Полученные данные говорят о необходимости поиска новых технологий консервирования биотрансплантатов для повышения качества заготавливаемых органов и тканей.
консервирование
хранение
заготовка
пересадка органов и тканей
биотрансплантат
1. Григорьянц Л.А. Показания и эффективность использования различных хирургических вмешательств при лечении больных с одонтогенным гайморитом, вызванным выведением пломбировочного материала в верхнечелюстной синус / Григорьянц Л.А., Сирак С.В., Зекерьяев Р.С., Арутюнян К.Э. // Стоматология. 2007. — Т. 86. — № 3. — С. 42–46.
2. Григорьянц Л.А. Использование препарата Цифран СТ в хирургической стоматологии для лечения и профилактики послеоперационных воспалительных осложнений / Григорьянц Л.А., Герчиков Л.Н., Бадалян В.А., Сирак С.В., Григорьянц А.Г. // Стоматология для всех. — 2006. — № 2. — С. 14–16.
3. Григорьян А.А. Разработка и клиническое применение нового ранозаживляющего средства для лечения заболеваний слизистой оболочки полости рта у детей и подростков / Григорьян А.А., Сирак С.В., Сирак А.Г., Ханова С.А. // Современные проблемы науки и образования. — 2013. — № 2. — С. 41.
4. Слетов А.А. Экспериментальное определение регенераторного потенциала клеток костного мозга / Слетов А.А., Переверзев Р.В., Ибрагимов И.М., Кодзоков Б.А., Сирак С.В. // Стоматология для всех. — 2012. — № 2. — С. 29–31.
5. Сирак С.В. Клинико-анатомическое обоснование лечения и профилактики травм нижнеальвеолярного нерва, вызванных выведением пломбировочного материала в нижнечелюстной канал / Сирак С.В.: диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук / ФГУ «Центральный научно-исследовательский институт стоматологии». М., 2006.
6. Сирак С.В. Изучение особенностей анатомо-топографического строения нижней челюсти для планирования эндодонтического и имплантологического лечения / Сирак С.В., Долгалев А.А., Слетов А.А., Михайленко А.А. // Институт стоматологии. — 2008. — Т. 2. — № 39. — С. 84–87.
7. Сирак С.В. Использование поликомпонентной адгезивной мази в сочетании с иммуномодулирующим препаратом в комплексной терапии пузырчатки / Сирак С.В., Копылова И.А., Чеботарев В.В., Аль-асфари Ф.М.С.//Пародонтология. — 2012. — Т. 17. — № 2. — С. 62–65.
8. Сирак С.В. Опыт использования местных ранозаживляющих средств при лечении вульгарной пузырчатки с локализацией на слизистой оболочке полости рта и губах / С.В. Сирак, В.В. Чеботарев, А.Г. Сирак, А.А. Григорьян // Медицинский вестник Северного Кавказа. — 2013. — Т. 8. — № 1. — С. 59–62.
9. Сирак С.В. Влияние пористого титана на остеогенный потенциал клеток костного мозга in vitro / Сирак С.В., Слетов А.А., Ибрагимов И.М., Кодзоков Б.А. // Медицинский вестник Северного Кавказа. — 2012. — Т. 27. — № 3. — С. 22–25.
10. Сирак С.В. Оценка риска осложнений эндодонтических манипуляций на основе показателей анатомо-топографического строения нижней челюсти / Сирак С.В., Коробкеев А.А., Шаповалова И.А., Михайленко А.А. // Эндодонтия Today. — 2008. — № 2. — С. 55–60.
11. Сирак С.В. Стоматологическая заболеваемость детского населения ставропольского края до и после внедрения программы профилактики/Сирак С.В., Шаповалова И.А., Максимова Е.М., Пригодин С.Н. // Стоматология детского возраста и профилактика. — 2009. — Т. 8. — № 1. — С. 64–66.
12. Сирак А.Г. Морфофункциональные изменения в пульпе зубов экспериментальных животных при лечении глубокого кариеса и острого очагового пульпита с использованием разработанных лекарственных композиций / Сирак А.Г., Сирак С.В. // Современные проблемы науки и образования. — 2013. — № 2. С. 44.
13. Mikhalchenko D.V. Influence of transcranial electrostimulation on the osseointegration of dental implant in the experiment/Mikhalchenko D.V., Poroshin A.V., Mikhalchenko V.F., Firsova I.V., Sirak S.V.//Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. — 2014. — Т. 5. — № 5. — С. 705–711.
14. Grimm W.D. Complex, three-dimensional reconstruction of critical size defects following delayed implant placement using stem cell-containing subepithelial connective tissue graft and allogenic human bone blocks for horizontal alveolar bone augmentation:a case report as proof of clinical study principles/Grimm Dr.W.D., Plöger Dr.M., Schau Dr.I., Vukovic Dr.M.A., Shchetinin E., Akkalaev A.B., Avanesian R.A., Sirak S.V.//Медицинский вестник Северного Кавказа. — 2014. — Т. 9. — № 2 (34). — С. 131–133.
15. Grimm W.D. Prefabricated 3d allogenic bone block in conjunction with stem cell-containing subepithelial connective tissue graft for horizontal alveolar bone augmentation:a case report as proof of clinical study principleS/Grimm W.D., Plöger M., Schau I., Vukovic M.A., Shchetinin E., Akkalaev A.B., Arutunov A.V., Sirak S.V.//Медицинский вестник Северного Кавказа. — 2014. — Т. 9. — № 2 (34). — С. 175–178.
16. Sirak S.V. Clinical and morphological substantiation of treatment of odontogenic cysts of the maxilla/Sirak S.V., Arutyunov A.V., Shchetinin E.V., Sirak A.G., Akkalaev A.B., Mikhalchenko D.V.//Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. — 2014. — Т. 5. — № 5. С. — 682–690.
17. Sirak S.V. Microbiocenosis of oral cavity in patients with dental implants and over-dentures/Sirak S.V., Avanesyan R.A., Akkalaev A.B., Demurova M.K., Dyagtyar E.A., Sirak A.G.//Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. — 2014. — Т. 5. — № 5. — С. 698–704.
18. Sirak S.V. Social composition and motivation of patients in applying for implant dental service/Sirak S.V., Avanesyan R.A., Sirak A.G., Shchetinin E.V., Demurova M.K.//Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. — 2014. — Т. 5. — № 5. — С. 691–697.
Трансплантация органов и тканей является одной из наиболее актуальных проблем современной медицины [3, 5, 7, 12]. Особенно остро на повестке дня стоит вопрос об адаптации пересаживаемых тканей организму реципиента [1, 4, 6, 8]. Главным препятствием на пути создания надежных способов длительной консервации органов (3 суток и более), а также организации банков - хранилищ органов являются биологические проблемы выживаемости клеток и органов в условиях ишемии, которая действует на донорские органы на всех этапах: в организме донора, при изъятии, консервации, в период трансплантации и даже в раннем посттрансплантационном периоде [2, 9, 10, 11, 13]. Поэтому методы консервации органов и тканей становятся важным разделом трансплантологии и являются вспомогательным мероприятием и этапом трансплантации. Известно, что способы консервирования органов и тканей зависят от вида воздействия на трансплантат.

1. Заместительное консервирование:

1) биологическая перфузия;

2) нормотермическая аппаратная перфузия.

2. Консервирование, подавляющее обмен веществ:

1) охлаждение до температуры, близкой к 0°С, в жидких солевых средах или в других жидкостях без питательных веществ;

2) гипотермическая перфузия;

3) проточный метод;

4) бесперфузионный метод.

3. Охлаждение в твердых средах до температуры близкой к 0°С;

4. Замораживание при температуре ниже 0°С:

1) при температуре от 1°С до -50°С;

2) при температуре от 51°С до -100°С;

3) при температуре от -101°С до -273°С;

4) замораживание с высушиванием (лиофилизация).

5. Комбинированное (заместительное или подавляющее обмен веществ) консервирование:

1) гипотермическая перфузия плазмозамещающими растворами;

2) гипотермия в сочетании с гипербарической оксигенацией;

3) сочетание гипотермии, гипербарической оксигенациии, перфузии;

4) бесперфузионное охлаждение до температуры, близкой к 0°С, в жидких средах, содержащих кровь, плазму, сахара, АТФ и др. [4, 15, 16].

Значительное место среди различных методов консервирования занимают жидкие консервирующие среды (изотонический и гипертонический растворы хлорида натрия, жидкость Тирода, раствор Тингера-Локка, слабые растворы карболовой кислоты, хлорамина, мертиолата, диоцида, фурацилина, формальдегида, глутаральдегида, этилового спирта). Целесообразность их применения связана с возможностью создания благоприятных условий для консервируемых тканей. Изотоничность, изогидричность, ионно-электролитная уравновешенность - вот те свойства, которые необходимы для сохранения тканей в физиологически полноценном состоянии [17, 18]. Использование жидких консервирующих сред мы считаем перспективным, потому что подбором составляющих их компонентов можно влиять на генетический код консервируемой ткани, сохранять ее в состоянии анабиоза, «когда жизнь приостанавливается, прерывается более или менее полно...» (П.Ю. Шмидт, 1955) под влиянием различных угнетающих условий, и, наконец, бороться с микробным загрязнением ткани.

Цель исследования

С помощью экспериментально-лабораторных исследований определить характер воздействия различных консервирующих растворов на органы и ткани для оценки эффективности современных методов заготовки биотрансплантатов.

Материал и методы исследования

Основной компонент всех консервирующих растворов и гелей - формалин, так как при использовании формалинизированных трансплантатов явления тканевой несовместимости устраняются. Исходя из важности этого вывода, было проведено лабораторное исследование иммунологической активности гомологичной кожи при воздействии на нее различными физическими и химическими средствами, нашедшими применение при консервировании тканей. Выбор кожи обусловлен ее активностью в антигенном отношении. Опыты осуществлялись по принятой методике: животных (кроликов) сенсибилизировали подкожным введением 1 мл экстракта кожи. Чрез 15-16 суток им внутривенно вводили разрешающую дозу того же экстракта в количестве 9-10 мл.

Методика приготовления экстракта: кожу гомогенизируют растиранием с толченым стеклом в ступке до получения абсолютно гомогенной кашицы. Растворимые белки извлекают физиологическим раствором путем прибавления его к гомогенату в отношении 2:1. Затем при непрерывном встряхивании сюда же добавляют эфир до полного насыщения гомогената. Пробирки с гомогенатом центрифугируют в течение 15 мин при охлаждении льдом с поваренной солью. Из трех слоев, образующихся после центрифугирования (эфир, экстракт, осадок), экстракт отсасывают и используют для изучения. Содержание белка в экстракте определялось рефрактометрически и в среднем составляло 1,48-1,54%. Экстракт изготовлен из свежей кожи (контрольная серия), высушенной, хранившейся при 2-4°C в 2‰-ном растворе хлорамина, растворе Люголя, 70°- и 96°-ном спиртах и 3%-ном формалине (опытные серии) при экспозиции 12 ч, 1, 3, 5, 10 суток.

Далее, по вышеописанной методике сенсибилизации с последующим введением разрешающей дозы мы изучили влияние 0,25-, 0,5-, 0,75-, 1-, 1,5- и 3%-ного растворов формальдегида при экспозиции от 12 ч до 10 суток на иммунологическую активность гомологичной кожи.

Существующим методам консервирования присуще весьма нежелательное явление - уменьшение запаса прочности костной ткани. Для ответа на вопрос, ухудшаются ли механические свойства кости, консервированной при помощи формалина, предпринято настоящее исследование. Испытывались свежая и консервированная (0,25-0,5%-ные растворы формалина от 1 суток до 6 месяцев) кость. Из консервированной кости выпиливались циркулярные фрагменты длиной 10 мм. Из многих методов объективной оценки механических свойств костной ткани мы остановили свой выбор на изучении прочности сжатию, так как давление является постоянным и самым сильным механическим фактором внешней среды. Прочность на сжатие (δ сж) представляет отношение усилия (P), вызывающего разрушение ткани, к площади ее поперечного сечения (F). Определение усилия, приводящего к разрушению кости, производилось на приборе, используемом для испытания механической прочности материалов.

Результаты

При введении разрешающей дозы экстракта из консервированной названными способами кожи (за исключением формалинизированной), независимо от экспозиции, у кроликов развивалась характерная клиническая картина анафилактического шока. Животные погибали через 50-150 с. На вскрытии обнаруживались однотипные изменения: переполнение правой половины сердца венозной кровью, резкая гиперемия печени, венозный застой в органах брюшной полости, спазм мочевого пузыря. Введение экстракта из формалинизированной кожи не вызывало смерти животных, что свидетельствует об изменении иммунологических свойств такой кожи.

Таблица 1

Воздействие физических и химических факторов на антигенную активность тканей

Фактор

+4°C

3%-ный р-р

формалина

2%-ный р-р

хлорамина

р-р Люголя

96°-ный спирт

70°-ный спирт

Неконсервированная

ткань

Экспозиция

Реакция животного

1 сутки

3 суток

5 суток

10 суток

смерть

-

-

-

нет

-

-

-

смерть

-

-

-

смерть

-

-

-

смерть

-

-

-

смерть

-

-

-

смерть

-

-

-

У контрольных кроликов уже к концу введения экстракта наблюдалась кратковременная адинамия, атония, затем следовала остановка дыхания на 10-15 с и ослабление сердечных сокращений. В течение 3-4 мин состояние животных постепенно возвращалось к исходному.

Таблица 2

Изменение антигенной активности тканей при консервации их в растворах формалина различных концентраций и при различной экспозиции.

Концентрация

0,25%

0,5%

0,75%

1%

1,5%

3%

Неконсервированная

ткань

Экспозиция

Реакция животного

12 часов

очень сильная

сильная

слабая

очень слабая

очень слабая

нет

смерть

1 сутки

сильная

слабая

очень

слабая

очень

слабая

нет

-

-

3 суток

слабая

слабая

очень

слабая

нет

-

-

-

5 суток

очень

слабая

очень

слабая

нет

-

-

-

-

10 суток

нет

нет

-

-

-

-

-

Результаты опытов учитывали по степени реакции кроликов на введение разрешающей дозы экстракта.

1. Очень сильная реакция - утрачивались роговичные рефлексы, падал мышечный тонус. В течение 1,5-2 мин после введения разрешающей дозы у кроликов обнаруживались явления адинамии, атонии скелетной мускулатуры при очень редком дыхании и резком ослаблении сердечных сокращений. Восстановление утраченных функций и возврат к исходному состоянию происходил в течение 5-7 мин.

2. Сильная реакция - не отмечались полная адинамия и атония скелетной мускулатуры, сохранялись роговичные рефлексы. Восстановление утраченных функций наступало через 3 мин.

3. Слабая реакция - сохранялись роговичные рефлексы, мышечный тонус. Резкое учащение сердцебиений и дыхания. Возврат к исходному состоянию через 1,5-2 мин.

4. Очень слабая реакция - незначительно учащались сердцебиение и дыхание.

Введение экстракта животным не сопровождалось реакцией при консервировании кожи в 0,25-0,5%-ных растворах формалина на 10-е сутки, при консервировании в 0,75-ном и 1%-ном растворах на 5-е сутки и, наконец, при консервировании в 1,5%-ном растворе на 3-и сутки.

Следовательно, изменение иммунологической активности гомологичной кожи при консервировании в растворах формалина слабых концентраций находится в прямо пропорциональной зависимости от процентного содержания формалина и экспозиции в консервирующем растворе. При испытании прочности на сжатие свежей и консервированной кости получены следующие результаты  (табл. 3).

Таблица 3

Механическая прочность консервированной костной ткани при различных концентрациях раствора формалина

Время

% раствора формалина

0,25%-ный р-р

0,5%-ный р - р

3 суток

- 8,9-9,0 кг/мм²

- 8,8-9,1 кг/мм²

15 суток

- 8,8-9,0 кг/мм²

- 8,8-9,0 кг/мм²

1 месяц

- 8,8-8,9 кг/мм²

- 8,8-9,0 кг/мм²

2 месяца

- 8,7-9,1 кг/мм²

- 8,7-8,9 кг/мм²

3 месяца

- 8,5-8,8 кг/мм²

- 8,7-8,9 кг/мм²

4 месяца

- 8,7-8,8 кг/мм²

- 8,7-8,8 кг/мм²

5 месяцев

- 8,3-8,5 кг/мм²

- 8,6-8,7 кг/мм²

6 месяцев

- 8,0-8,2 кг/мм²

- 8,5-8,6 кг/мм²

Как видно, механическая прочность консервированной костной ткани уменьшается, причем снижение прочности на сжатие более заметно при использовании в качестве консерванта 0,25%-ного раствора формалина.

Заключение

Существующие методы консервации трансплантатов не позволяют сохранить все остеоиндуктивные мио-, нео- и реваскуляризующие свойства тканей, сохранить жизнеспособность клеток на протяжении всего срока консервации и тем самым исключить отторжение трансплантата от органа реципиента. Необходимо создание для консервируемых тканей условий, близких к нормальной жизнедеятельности организма. В связи с этим возникает необходимость поиска новой технологии стерилизации, консервации и транспортировки свободных кожно-мышечных, нервных, хрящевых, костных реваскуляризируемых трансплантатов, которая будет позволять заготавливать органы и ткани, создавать запасы трансплантатов в банке трансплантированных тканей для использования их по мере необходимости, производить обмен трансплантатами между различными медицинскими учреждениями, находящимися за многие сотни километров от места получения трансплантата.

Рецензенты:

Слетов А.А., д.м.н., профессор кафедры челюстно-лицевой хирургии ГБОУ ВПО «Ставропольский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Ставрополь;

Калиниченко А.А., д.м.н., главный врач клиники «Фитодент», г. Михайловск.


Библиографическая ссылка

Аванесян Р.А., Ивлева А.Д. ЭКПЕРИМЕНТАЛЬНО-ЛАБОРАТОРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТОДОВ КОНСЕРВИРОВАНИЯ БИОТРАНСПЛАНТАТОВ // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 4. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=20797 (дата обращения: 18.09.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074