Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

EXPERIMENTAL LABORATORY STUDY OF METHODS OF PRESERVING BIOTRANSPLANT

Avanesyan R.A. 1 Ivleva A.D. 1
1 Stavropol State Medical University
The article is devoted to the study of methods of preserving biotransplant and their effects on organs and tissues from laboratory experiments on animals. A study was conducted immunological activity of homologous skin, when exposed to various chemical and physical factors which have found application in the preservation of tissues. Animals (rabbits) were sensitized by subcutaneous injection of 1 ml of the extract of the skin. After 15-16 days they entered the resolving dose of the same extract in the amount of 9-10 ml. Thus a comparison of the effects of different preservative fluids on the antigenic activity of tissues. Using the same methodology a comparison of the effect of 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5 and 3% solutions of formaldehyde exposure time from 12 hours to 10 days on the immunological activity of homologous skin. The results of the experiments showed that the change in the immunological activity of homologous skin for canning in solutions of weak formalin concentration is directly proportional to the percentage content of formalin and exposure in the preservative solution. Other test results of physical properties of normal and canned bone tissue showed that the mechanical strength of canned bone tissue decreases, and it is more noticeable when used as a preservative with 0,25% formalin. The findings indicate the need to find new technologies for the preservation of biotransplant to improve the quality of harvested organs and tissues.
conservation
storage
harvesting
transplantation of organs and tissues
biotransplant
Трансплантация органов и тканей является одной из наиболее актуальных проблем современной медицины [3, 5, 7, 12]. Особенно остро на повестке дня стоит вопрос об адаптации пересаживаемых тканей организму реципиента [1, 4, 6, 8]. Главным препятствием на пути создания надежных способов длительной консервации органов (3 суток и более), а также организации банков - хранилищ органов являются биологические проблемы выживаемости клеток и органов в условиях ишемии, которая действует на донорские органы на всех этапах: в организме донора, при изъятии, консервации, в период трансплантации и даже в раннем посттрансплантационном периоде [2, 9, 10, 11, 13]. Поэтому методы консервации органов и тканей становятся важным разделом трансплантологии и являются вспомогательным мероприятием и этапом трансплантации. Известно, что способы консервирования органов и тканей зависят от вида воздействия на трансплантат.

1. Заместительное консервирование:

1) биологическая перфузия;

2) нормотермическая аппаратная перфузия.

2. Консервирование, подавляющее обмен веществ:

1) охлаждение до температуры, близкой к 0°С, в жидких солевых средах или в других жидкостях без питательных веществ;

2) гипотермическая перфузия;

3) проточный метод;

4) бесперфузионный метод.

3. Охлаждение в твердых средах до температуры близкой к 0°С;

4. Замораживание при температуре ниже 0°С:

1) при температуре от 1°С до -50°С;

2) при температуре от 51°С до -100°С;

3) при температуре от -101°С до -273°С;

4) замораживание с высушиванием (лиофилизация).

5. Комбинированное (заместительное или подавляющее обмен веществ) консервирование:

1) гипотермическая перфузия плазмозамещающими растворами;

2) гипотермия в сочетании с гипербарической оксигенацией;

3) сочетание гипотермии, гипербарической оксигенациии, перфузии;

4) бесперфузионное охлаждение до температуры, близкой к 0°С, в жидких средах, содержащих кровь, плазму, сахара, АТФ и др. [4, 15, 16].

Значительное место среди различных методов консервирования занимают жидкие консервирующие среды (изотонический и гипертонический растворы хлорида натрия, жидкость Тирода, раствор Тингера-Локка, слабые растворы карболовой кислоты, хлорамина, мертиолата, диоцида, фурацилина, формальдегида, глутаральдегида, этилового спирта). Целесообразность их применения связана с возможностью создания благоприятных условий для консервируемых тканей. Изотоничность, изогидричность, ионно-электролитная уравновешенность - вот те свойства, которые необходимы для сохранения тканей в физиологически полноценном состоянии [17, 18]. Использование жидких консервирующих сред мы считаем перспективным, потому что подбором составляющих их компонентов можно влиять на генетический код консервируемой ткани, сохранять ее в состоянии анабиоза, «когда жизнь приостанавливается, прерывается более или менее полно...» (П.Ю. Шмидт, 1955) под влиянием различных угнетающих условий, и, наконец, бороться с микробным загрязнением ткани.

Цель исследования

С помощью экспериментально-лабораторных исследований определить характер воздействия различных консервирующих растворов на органы и ткани для оценки эффективности современных методов заготовки биотрансплантатов.

Материал и методы исследования

Основной компонент всех консервирующих растворов и гелей - формалин, так как при использовании формалинизированных трансплантатов явления тканевой несовместимости устраняются. Исходя из важности этого вывода, было проведено лабораторное исследование иммунологической активности гомологичной кожи при воздействии на нее различными физическими и химическими средствами, нашедшими применение при консервировании тканей. Выбор кожи обусловлен ее активностью в антигенном отношении. Опыты осуществлялись по принятой методике: животных (кроликов) сенсибилизировали подкожным введением 1 мл экстракта кожи. Чрез 15-16 суток им внутривенно вводили разрешающую дозу того же экстракта в количестве 9-10 мл.

Методика приготовления экстракта: кожу гомогенизируют растиранием с толченым стеклом в ступке до получения абсолютно гомогенной кашицы. Растворимые белки извлекают физиологическим раствором путем прибавления его к гомогенату в отношении 2:1. Затем при непрерывном встряхивании сюда же добавляют эфир до полного насыщения гомогената. Пробирки с гомогенатом центрифугируют в течение 15 мин при охлаждении льдом с поваренной солью. Из трех слоев, образующихся после центрифугирования (эфир, экстракт, осадок), экстракт отсасывают и используют для изучения. Содержание белка в экстракте определялось рефрактометрически и в среднем составляло 1,48-1,54%. Экстракт изготовлен из свежей кожи (контрольная серия), высушенной, хранившейся при 2-4°C в 2‰-ном растворе хлорамина, растворе Люголя, 70°- и 96°-ном спиртах и 3%-ном формалине (опытные серии) при экспозиции 12 ч, 1, 3, 5, 10 суток.

Далее, по вышеописанной методике сенсибилизации с последующим введением разрешающей дозы мы изучили влияние 0,25-, 0,5-, 0,75-, 1-, 1,5- и 3%-ного растворов формальдегида при экспозиции от 12 ч до 10 суток на иммунологическую активность гомологичной кожи.

Существующим методам консервирования присуще весьма нежелательное явление - уменьшение запаса прочности костной ткани. Для ответа на вопрос, ухудшаются ли механические свойства кости, консервированной при помощи формалина, предпринято настоящее исследование. Испытывались свежая и консервированная (0,25-0,5%-ные растворы формалина от 1 суток до 6 месяцев) кость. Из консервированной кости выпиливались циркулярные фрагменты длиной 10 мм. Из многих методов объективной оценки механических свойств костной ткани мы остановили свой выбор на изучении прочности сжатию, так как давление является постоянным и самым сильным механическим фактором внешней среды. Прочность на сжатие (δ сж) представляет отношение усилия (P), вызывающего разрушение ткани, к площади ее поперечного сечения (F). Определение усилия, приводящего к разрушению кости, производилось на приборе, используемом для испытания механической прочности материалов.

Результаты

При введении разрешающей дозы экстракта из консервированной названными способами кожи (за исключением формалинизированной), независимо от экспозиции, у кроликов развивалась характерная клиническая картина анафилактического шока. Животные погибали через 50-150 с. На вскрытии обнаруживались однотипные изменения: переполнение правой половины сердца венозной кровью, резкая гиперемия печени, венозный застой в органах брюшной полости, спазм мочевого пузыря. Введение экстракта из формалинизированной кожи не вызывало смерти животных, что свидетельствует об изменении иммунологических свойств такой кожи.

Таблица 1

Воздействие физических и химических факторов на антигенную активность тканей

Фактор

+4°C

3%-ный р-р

формалина

2%-ный р-р

хлорамина

р-р Люголя

96°-ный спирт

70°-ный спирт

Неконсервированная

ткань

Экспозиция

Реакция животного

1 сутки

3 суток

5 суток

10 суток

смерть

-

-

-

нет

-

-

-

смерть

-

-

-

смерть

-

-

-

смерть

-

-

-

смерть

-

-

-

смерть

-

-

-

У контрольных кроликов уже к концу введения экстракта наблюдалась кратковременная адинамия, атония, затем следовала остановка дыхания на 10-15 с и ослабление сердечных сокращений. В течение 3-4 мин состояние животных постепенно возвращалось к исходному.

Таблица 2

Изменение антигенной активности тканей при консервации их в растворах формалина различных концентраций и при различной экспозиции.

Концентрация

0,25%

0,5%

0,75%

1%

1,5%

3%

Неконсервированная

ткань

Экспозиция

Реакция животного

12 часов

очень сильная

сильная

слабая

очень слабая

очень слабая

нет

смерть

1 сутки

сильная

слабая

очень

слабая

очень

слабая

нет

-

-

3 суток

слабая

слабая

очень

слабая

нет

-

-

-

5 суток

очень

слабая

очень

слабая

нет

-

-

-

-

10 суток

нет

нет

-

-

-

-

-

Результаты опытов учитывали по степени реакции кроликов на введение разрешающей дозы экстракта.

1. Очень сильная реакция - утрачивались роговичные рефлексы, падал мышечный тонус. В течение 1,5-2 мин после введения разрешающей дозы у кроликов обнаруживались явления адинамии, атонии скелетной мускулатуры при очень редком дыхании и резком ослаблении сердечных сокращений. Восстановление утраченных функций и возврат к исходному состоянию происходил в течение 5-7 мин.

2. Сильная реакция - не отмечались полная адинамия и атония скелетной мускулатуры, сохранялись роговичные рефлексы. Восстановление утраченных функций наступало через 3 мин.

3. Слабая реакция - сохранялись роговичные рефлексы, мышечный тонус. Резкое учащение сердцебиений и дыхания. Возврат к исходному состоянию через 1,5-2 мин.

4. Очень слабая реакция - незначительно учащались сердцебиение и дыхание.

Введение экстракта животным не сопровождалось реакцией при консервировании кожи в 0,25-0,5%-ных растворах формалина на 10-е сутки, при консервировании в 0,75-ном и 1%-ном растворах на 5-е сутки и, наконец, при консервировании в 1,5%-ном растворе на 3-и сутки.

Следовательно, изменение иммунологической активности гомологичной кожи при консервировании в растворах формалина слабых концентраций находится в прямо пропорциональной зависимости от процентного содержания формалина и экспозиции в консервирующем растворе. При испытании прочности на сжатие свежей и консервированной кости получены следующие результаты  (табл. 3).

Таблица 3

Механическая прочность консервированной костной ткани при различных концентрациях раствора формалина

Время

% раствора формалина

0,25%-ный р-р

0,5%-ный р - р

3 суток

- 8,9-9,0 кг/мм²

- 8,8-9,1 кг/мм²

15 суток

- 8,8-9,0 кг/мм²

- 8,8-9,0 кг/мм²

1 месяц

- 8,8-8,9 кг/мм²

- 8,8-9,0 кг/мм²

2 месяца

- 8,7-9,1 кг/мм²

- 8,7-8,9 кг/мм²

3 месяца

- 8,5-8,8 кг/мм²

- 8,7-8,9 кг/мм²

4 месяца

- 8,7-8,8 кг/мм²

- 8,7-8,8 кг/мм²

5 месяцев

- 8,3-8,5 кг/мм²

- 8,6-8,7 кг/мм²

6 месяцев

- 8,0-8,2 кг/мм²

- 8,5-8,6 кг/мм²

Как видно, механическая прочность консервированной костной ткани уменьшается, причем снижение прочности на сжатие более заметно при использовании в качестве консерванта 0,25%-ного раствора формалина.

Заключение

Существующие методы консервации трансплантатов не позволяют сохранить все остеоиндуктивные мио-, нео- и реваскуляризующие свойства тканей, сохранить жизнеспособность клеток на протяжении всего срока консервации и тем самым исключить отторжение трансплантата от органа реципиента. Необходимо создание для консервируемых тканей условий, близких к нормальной жизнедеятельности организма. В связи с этим возникает необходимость поиска новой технологии стерилизации, консервации и транспортировки свободных кожно-мышечных, нервных, хрящевых, костных реваскуляризируемых трансплантатов, которая будет позволять заготавливать органы и ткани, создавать запасы трансплантатов в банке трансплантированных тканей для использования их по мере необходимости, производить обмен трансплантатами между различными медицинскими учреждениями, находящимися за многие сотни километров от места получения трансплантата.

Рецензенты:

Слетов А.А., д.м.н., профессор кафедры челюстно-лицевой хирургии ГБОУ ВПО «Ставропольский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Ставрополь;

Калиниченко А.А., д.м.н., главный врач клиники «Фитодент», г. Михайловск.