Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ТКАНЕЙ ПТИЦ

Ржепаковский И.В. 1 Тимченко Л.Д. 1 Писков С.И. 1 Вакулин В.Н. 1 Пономаренко А.П. 1
1 ФГАОУ ВПО «Северо-Кавказский федеральный университет»
На основании анализа литературы выявлена необходимость разработки и совершенствования биотехнологии тканевых препаратов для ветеринарии. Выбор сырья для биотехнологического продукта, разрабатываемого для ветеринарных целей, имеет принципиальное значение, поскольку наряду с биотехнологическими потенциями, обеспечивающими специфическую эффективность, сырьевой объект должен отвечать критериям, обусловливающим экономический эффект при производстве и применении готового продукта. В настоящее время в биотехнологии расширяется тенденция к использованию в технологических схемах эукариотических клеток, целых многоклеточных организмов или их тканей и органов. Реализован эксперимент по совершенствованию технологии получения тканевого препарата на основе эмбриональных тканей птиц, основанный на использовании технологических преимуществ метода гомогенизации под высоким давлением – High pressure homogenization. На основе физико-химических исследований (однородность препарата, дзета-потенциал, размер частиц, концентрация белка, дезоксирибонуклеиновой кислоты, рибонуклеиновой кислоты и характеристические спектры поглощения), в сравнении с препаратом «СТЭМБ», доказана возможность получения принципиально нового биологически активного тканевого препарата с применением в технологической схеме метода гомогенизации под высоким давлением (HPH).
биотехнология тканевых препаратов
эмбриональные ткани птиц
гомогенизация под высоким давлением
физико-химические исследования
1. Василов Р.Г. Перспективы развития современной медицинской биотехнологии // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. – 2011. – Т. 7, № 4. – С. 13-17.
2. Девришов Д.А., Жарова Т.П. Иммуномодулирующие свойства «Бурсина» // Ветеринарная медицина. – 2009. – № 1-2. – С. 32-34.
3. Рейдл К.А. Эффективность влияния некоторых тканевых препаратов на рост, развитие, резистентность и раневой процесс у поросят подсосного периода: дис. … д-ра ветерин. наук. – Тарту, 1986. – С. 14-62.
4. Ржепаковский И.В., Тимченко Л.Д., Вакулин В.Н., Ржепаковский В.В. Экспериментальное обоснование технологии приготовления препарата «СТЭМБ» // Вестник Московского государственного областного университета. Серия: Естественные науки. – 2010. – № 1. – С. 56-60.
5. Санин А.В., Наровлянский А.Н., Пронин А.В. Иммуномодуляторы в сельском хозяйстве – дань моде или необходимость // Российский ветеринарный журнал. – 2011. – №1. – С 37-40.
6. Серебряная Н.Б., Новик А.А. ДНК как иммуностимулятор (обзор литературы) // Медицинская иммунология. – 2001. – № 1. – С. 27-34.
7. Сизов А.А. Исследование свойств экстрактов и компонентов эмбриональных тканей птиц раннего срока развития и получение на их основе ветеринарного препарата иммуностимулирующего действия: дис. … канд. биол. наук. – Новосибирск, 1996. – 116 с.
8. Тимченко Л.Д., Ржепаковский И.В., Арешидзе Д.А. Перспективы использования биологически активных препаратов на основе экстрактов эмбриональных тканей кур // Вестник Московского государственного областного университета. Серия: Естественные науки. – 2009. – № 2. – С. 94-97.
9. Тимченко Л.Д., Ржепаковский И.В., Михайленко В.В. и др. Способ приготовления биостимулятора эмбрионального // Патент России № 2197251, 2003, Бюл. № 3.
10. Barnadas-Rodríguez R., Sabés M. Factors involved in the production of liposomes with a high-pressure homogenizer // International journal of pharmaceutics. – 2001. – V. 213, № 1-2. – P. 175-186.

Введение

Конец XX и начало XXI века ознаменовались бурным развитием биотехнологий. Биотехнологическим способом производят генно-инженерные белки (интерфероны, интерлейкины, инсулин, вакцины против гепатита и т.п.), ферменты, диагностические средства (тест-системы на наркотики, лекарственные вещества, гормоны и т.п.), витамины, антибиотики, биодеградируемые пластмассы, биосовместимые материалы, биологически активные препараты и т.д. [1].

Совершенно очевидно, что в сфере производства лекарственных средств и биологически активных добавок, как для человека, так и для животных, биотехнология вытесняет традиционные технологии и открывает принципиально новые возможности.

Определяющим фрагментом биотехнологического процесса является выбор качественного и потенциально богатого биологически активными веществами сырья. При этом использование биообъектов в качестве источников сырья является на сегодняшний день одним из наиболее перспективных направлений ветеринарной фармакологии.

Не менее важными и кардинально влияющими на качество препаратов являются манипуляции с биообъектом, повышающие его активность, как в процессе жизнедеятельности, так и в процессе его непосредственной технологической переработки, к которой традиционно относят измельчение и гомогенизацию, обеспечиваемые в настоящее время различными способами. Это позволяет добиться повышения количественного и качественного уровней биологически активных веществ не только в результате управления на разных этапах онтогенеза функциональными преобразованиями в живой системе, но и за счет их высвобождения, структурирования и накопления в дисперсной системе, являющейся основой для конструирования различных препаративных форм.

Выбор сырья для биотехнологического продукта, разрабатываемого для ветеринарных целей, имеет принципиальное значение, поскольку наряду с биотехнологическими потенциями, обеспечивающими специфическую эффективность, сырьевой объект должен отвечать критериям, обусловливающим экономический эффект при производстве и применении готового продукта.

В качестве сырьевых объектов сегодня широко распространены представители бактерий и грибов, которые используются при производстве вакцин, анатоксинов, аллергенов, антибиотических, витаминных, пробиотических препаратов, аминокислот и микро-макроэлементов. Данные препараты занимают основную долю рынка ветеринарных препаратов.

Однако  в настоящее время в биотехнологии расширяется тенденция к использованию в технологических схемах эукариотических клеток, целых многоклеточных организмов или их тканей и органов. В этом направлении ведется работа по поиску удобных кандидатов на роль сырьевых источников, а также новых биотехнологий по их переработке, для получения фармакологических, в том числе ветеринарных средств нового поколения [5].

Издавна при производстве ветеринарных средств использовались субстанции животного происхождения, такие как кровь и различные органы и ткани. Эти субстанции использованы в качестве основы в технологии тканевых препаратов по методу профессора В.П. Филатова, которые получили свое распространение, начиная с 30-х годов 20 века в СССР. Тканевые препараты вплоть до 80-х годов 20 века активно внедрялись в медицинскую практику при лечении и для профилактики различных патологий [3].

Однако, последние 30 лет использование данных средств в клинике неоправданно ограничено и представлено единичными примерами, в то же время в научном плане продолжается разработка и испытание довольно большого числа тканевых препаратов [2, 7, 8]. При этом, несмотря на получение множества положительных результатов при использовании тканевых препаратов в научных испытаниях, этим все и ограничивается, без внедрения в производство.

Скорее всего, это связано со сложностью верификации результатов испытаний, а значит, и сертификации тканевых препаратов. В качестве причины этого можно рассматривать такую особенность тканевых препаратов, как их многокомпонентный состав, что связано с использованием биологических тканей, содержащих множество биологически активных веществ. С одной стороны, биологически активные вещества в таком препарате обладают высоким терапевтическим потенциалом, а, с другой стороны, за счет их разнообразия трудно добиться однородности, которая обеспечивается только путем диспергирования.

Традиционными и доступными производству методами не всегда удается добиться желаемого моноструктурирования и стабильности дисперсной системы, что ставит под сомнение степень биодоступности и повышает риск возможных осложнений. В настоящее время для решения этих проблем существует тенденция к включению в технологический процесс методов глубокой очистки - микрофильтрация, электрофорез и т.п. с выделением отдельных действующих начал, таких как, например РНК [7].

Однако при этом очистка и выделение отдельных действующих БАВ, по нашему мнению, приводят к значительному удорожанию препаратов, а также могут снижать их активность за счет потери различных, иногда крайне ценных, сопутствующих биологически активных компонентов.

Вышеперечисленные проблемы, связанные с недостатками степени измельчения, а соответственно экстракции, диспергирования и структурирования, и, как следствие, не задействованными потенциями сырьевой биосубстанции, отчасти касаются и разработанного нами ранее тканевого препарата «СТЭМБ», получаемого на основе высокоактивного биологического сырья - эмбриональных и внеэмбриональных тканей кур на 9-10-е сутки развития [9].

По своей сути СТЭМБ представляет собой тканевой препарат, эксклюзивные свойства которого достигаются за счет комплекса манипуляций, направленных на активацию эмбрионально-яичной массы, что позволяет повысить в субстрате уровень биологически активных веществ, в том числе за счет образования биогенных стимуляторов. Следует отметить, что содержащиеся в подобных средствах «биогенные стимуляторы» оказывают влияние на основные стороны обмена веществ, что выражается в изменении обменных и энергетических процессов организма [4, 8].

Мнение исследователей на природу биогенных стимуляторов разноречиво. Предположительно, они являются неоднородной по химической структуре группой биостимулирующих веществ. Однако многие ученые сходятся во мнении, что это низкомолекулярные органические соединения, к числу которых относят, например, органические кислоты, содержащиеся в живых клетках (дикарбоновые, трикарбоновые кислоты, РНК, ДНК и т.п.) и низкомолекулярные пептиды (цитамины) [3, 6, 7].

Поэтому максимальное извлечение этих веществ из клеток, накопление их в свободном виде в конечном продукте, а также стабилизация дисперсий, является принципиальной задачей технологического процесса.

Цель работы - совершенствование технологии получения тканевого препарата на основе эмбриональных тканей птиц, с использованием преимуществ метода гомогенизации под высоким давлением - High pressure homogenization (HPH).

Особенностью данного метода является высокая степень измельчения и гомогенизации тканевых и молекулярно-клеточных композитов сырьевого субстрата, что обеспечивает максимальный выход низкомолекулярных соединений в конечный продукт. По-нашему мнению, это может обеспечить его стабильность, высокую биодоступность и активность. Данный метод предполагает использование специального гомогенизатора высокого давления, способного проводить процесс при давлении до 2000 бар.

Технологической особенностью этого оборудования является наличие клапана с микрозазором, на который под высоким давлением и с низкой скоростью поступает негомогенизированный продукт. Это позволяет получить частицы микро и наноразмеров в зависимости от заданных параметров гомогенизации и свойств измельчаемого субстрата. Важнейшим итогом этого процесса является получение продукта, стандартизованного по физико-химическим параметрам (дзета-потенциал, размер и молекулярная масса частиц, коллоидная и термическая стабильность, химический состав) [10].

Материалы и методы исследования

В эксперименте воспроизведены основные этапы технологического процесса получения препарата «СТЭМБ» [3] и один цикл дополнительной гомогенизации при помощи лабораторного гомогенизатора высокого давления APV Lab Series Homogenizers 2000 при 1900 бар.

Определены физико-химические характеристики нового варианта препарата, в том числе дзета-потенциал, размер частиц образующих препарат, общее количество белка, РНК, ДНК и спектрофотометрический профиль, в сравнении с препаратом «СТЭМБ».

Для определения дзета-потенциала и размера частиц использовался анализатор Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, Великобритания), предоставленный научно-производственным объединением «СайТЭК» г. Ставрополь.

Для определения химического состава осуществляли:

1) количественную оценку содержания белков в образце методом специфической флуоресценции (флуориметр Qubit 2.0, Life Technologies, США);

2) количественную оценку содержания рибонуклеиновых кислот (РНК) в образце методом специфической флуоресценции (флуориметр Qubit 2.0, Life Technologies, США);

3) количественную оценку содержания дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК) в образце методом специфической флуоресценции (флуориметр Qubit 2.0, Life Technologies, США);

4) оценку характеристических спектров поглощения исследуемых образцов в диапазоне длин волн 190-840 нм (спектрофотометр NanoDrop 2000С, Thermo Fisher Scientific, США).

Результаты исследований

Биологически активный препарат, полученный с использованием гомогенизатора высокого давления, по сравнению с препаратом «СТЭМБ» приобрел признаки большей физической устойчивости. Кроме того, выявлено, что большинство частиц в препарате имеют диаметр ниже 100 nm и таким образом относятся к низкомолекулярным соединениям. Так, при применении НРН достоверно увеличилось количество общего белка, ДНК и в особенности РНК, соответственно на 71 мкг/мл (на 27,3 %), 0,34 мкг/мл (на 9,7 %) и 13,2 мкг/мл (на 194,1 %), что свидетельствует о более качественном разрушении клеточных структур и выходе в раствор биологически активных действующих веществ, обуславливающих биологическую активность препарата. Кроме того, расширение диапазона характеристических спектров вправо свидетельствует о качественном увеличении перечня БАВ в препарате, полученном с использованием HPH (табл. 1).

Таблица 1. Физико-химические свойства тканевого препарата, полученного с использованием HPH

Наименование показателя

Характеристика препарата «СТЭМБ» (контроль)

Характеристика препарата полученного с использованием HPH

Внешний вид

опалесцирующая жидкость желтоватого цвета с белым хлопьевидным осадком.

опалесцирующая жидкость желтоватого цвета с небольшим количеством мелкозернистого осадка.

Однородность препарата

при встряхивании образуется взвесь быстро выпадающая в осадок.

при встряхивании образуется однородная устойчивая взвесь.

Дзета-потенциал

минус 8,01 mV

минус 8,20 mV

Размер частиц

(средний диаметр, nm - количество, %)

35,13 d nm - 5,2 %

258,5 d nm - 80 %

2278 d nm - 14,7 %

27,92 d nm - 12,0 %

82,31 d nm - 55 %

623,8 d nm - 32,9 %

Общая концентрация белка, мкг/мл

260,0

331,0

Общая концентрация ДНК, мкг/мл

3,490

3,830

Общая концентрация РНК, мкг/мл

6,80

20,00

Характеристический спектр поглощения в диапазоне длин волн 190-840 нм

max 219 nm, 229 nm

max 215 nm, 228 nm,

275 nm

Заключение

Изменения в физико-химических параметрах неопровержимо свидетельствуют о том, что, несмотря на использование в обеих технологических схемах одной субстанции эмбрионального происхождения, применение технологии НРН обеспечивает получение качественно нового тканевого препарата.

Исследование проведено при финансовой поддержке Минобрнауки России, в рамках выполнения базовой части государственного задания (2014/2016).

Рецензенты:

Жарникова И.В., д.б.н., старший научный сотрудник, ведущий научный сотрудник научно-производственной лабораторией препаратов для диагностики особо опасных и других инфекций ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, г. Ставрополь.

Таран Т.В., д.м.н., старший научный сотрудник, заведующая лабораторией питательных сред для культивирования микроорганизмов 1-4 групп патогенности ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, г. Ставрополь.


Библиографическая ссылка

Ржепаковский И.В., Тимченко Л.Д., Писков С.И., Вакулин В.Н., Пономаренко А.П. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ТКАНЕЙ ПТИЦ // Современные проблемы науки и образования. – 2014. – № 3. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=13624 (дата обращения: 20.10.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074