Введение
Конец XX и начало XXI века ознаменовались бурным развитием биотехнологий. Биотехнологическим способом производят генно-инженерные белки (интерфероны, интерлейкины, инсулин, вакцины против гепатита и т.п.), ферменты, диагностические средства (тест-системы на наркотики, лекарственные вещества, гормоны и т.п.), витамины, антибиотики, биодеградируемые пластмассы, биосовместимые материалы, биологически активные препараты и т.д. [1].
Совершенно очевидно, что в сфере производства лекарственных средств и биологически активных добавок, как для человека, так и для животных, биотехнология вытесняет традиционные технологии и открывает принципиально новые возможности.
Определяющим фрагментом биотехнологического процесса является выбор качественного и потенциально богатого биологически активными веществами сырья. При этом использование биообъектов в качестве источников сырья является на сегодняшний день одним из наиболее перспективных направлений ветеринарной фармакологии.
Не менее важными и кардинально влияющими на качество препаратов являются манипуляции с биообъектом, повышающие его активность, как в процессе жизнедеятельности, так и в процессе его непосредственной технологической переработки, к которой традиционно относят измельчение и гомогенизацию, обеспечиваемые в настоящее время различными способами. Это позволяет добиться повышения количественного и качественного уровней биологически активных веществ не только в результате управления на разных этапах онтогенеза функциональными преобразованиями в живой системе, но и за счет их высвобождения, структурирования и накопления в дисперсной системе, являющейся основой для конструирования различных препаративных форм.
Выбор сырья для биотехнологического продукта, разрабатываемого для ветеринарных целей, имеет принципиальное значение, поскольку наряду с биотехнологическими потенциями, обеспечивающими специфическую эффективность, сырьевой объект должен отвечать критериям, обусловливающим экономический эффект при производстве и применении готового продукта.
В качестве сырьевых объектов сегодня широко распространены представители бактерий и грибов, которые используются при производстве вакцин, анатоксинов, аллергенов, антибиотических, витаминных, пробиотических препаратов, аминокислот и микро-макроэлементов. Данные препараты занимают основную долю рынка ветеринарных препаратов.
Однако в настоящее время в биотехнологии расширяется тенденция к использованию в технологических схемах эукариотических клеток, целых многоклеточных организмов или их тканей и органов. В этом направлении ведется работа по поиску удобных кандидатов на роль сырьевых источников, а также новых биотехнологий по их переработке, для получения фармакологических, в том числе ветеринарных средств нового поколения [5].
Издавна при производстве ветеринарных средств использовались субстанции животного происхождения, такие как кровь и различные органы и ткани. Эти субстанции использованы в качестве основы в технологии тканевых препаратов по методу профессора В.П. Филатова, которые получили свое распространение, начиная с 30-х годов 20 века в СССР. Тканевые препараты вплоть до 80-х годов 20 века активно внедрялись в медицинскую практику при лечении и для профилактики различных патологий [3].
Однако, последние 30 лет использование данных средств в клинике неоправданно ограничено и представлено единичными примерами, в то же время в научном плане продолжается разработка и испытание довольно большого числа тканевых препаратов [2, 7, 8]. При этом, несмотря на получение множества положительных результатов при использовании тканевых препаратов в научных испытаниях, этим все и ограничивается, без внедрения в производство.
Скорее всего, это связано со сложностью верификации результатов испытаний, а значит, и сертификации тканевых препаратов. В качестве причины этого можно рассматривать такую особенность тканевых препаратов, как их многокомпонентный состав, что связано с использованием биологических тканей, содержащих множество биологически активных веществ. С одной стороны, биологически активные вещества в таком препарате обладают высоким терапевтическим потенциалом, а, с другой стороны, за счет их разнообразия трудно добиться однородности, которая обеспечивается только путем диспергирования.
Традиционными и доступными производству методами не всегда удается добиться желаемого моноструктурирования и стабильности дисперсной системы, что ставит под сомнение степень биодоступности и повышает риск возможных осложнений. В настоящее время для решения этих проблем существует тенденция к включению в технологический процесс методов глубокой очистки - микрофильтрация, электрофорез и т.п. с выделением отдельных действующих начал, таких как, например РНК [7].
Однако при этом очистка и выделение отдельных действующих БАВ, по нашему мнению, приводят к значительному удорожанию препаратов, а также могут снижать их активность за счет потери различных, иногда крайне ценных, сопутствующих биологически активных компонентов.
Вышеперечисленные проблемы, связанные с недостатками степени измельчения, а соответственно экстракции, диспергирования и структурирования, и, как следствие, не задействованными потенциями сырьевой биосубстанции, отчасти касаются и разработанного нами ранее тканевого препарата «СТЭМБ», получаемого на основе высокоактивного биологического сырья - эмбриональных и внеэмбриональных тканей кур на 9-10-е сутки развития [9].
По своей сути СТЭМБ представляет собой тканевой препарат, эксклюзивные свойства которого достигаются за счет комплекса манипуляций, направленных на активацию эмбрионально-яичной массы, что позволяет повысить в субстрате уровень биологически активных веществ, в том числе за счет образования биогенных стимуляторов. Следует отметить, что содержащиеся в подобных средствах «биогенные стимуляторы» оказывают влияние на основные стороны обмена веществ, что выражается в изменении обменных и энергетических процессов организма [4, 8].
Мнение исследователей на природу биогенных стимуляторов разноречиво. Предположительно, они являются неоднородной по химической структуре группой биостимулирующих веществ. Однако многие ученые сходятся во мнении, что это низкомолекулярные органические соединения, к числу которых относят, например, органические кислоты, содержащиеся в живых клетках (дикарбоновые, трикарбоновые кислоты, РНК, ДНК и т.п.) и низкомолекулярные пептиды (цитамины) [3, 6, 7].
Поэтому максимальное извлечение этих веществ из клеток, накопление их в свободном виде в конечном продукте, а также стабилизация дисперсий, является принципиальной задачей технологического процесса.
Цель работы - совершенствование технологии получения тканевого препарата на основе эмбриональных тканей птиц, с использованием преимуществ метода гомогенизации под высоким давлением - High pressure homogenization (HPH).
Особенностью данного метода является высокая степень измельчения и гомогенизации тканевых и молекулярно-клеточных композитов сырьевого субстрата, что обеспечивает максимальный выход низкомолекулярных соединений в конечный продукт. По-нашему мнению, это может обеспечить его стабильность, высокую биодоступность и активность. Данный метод предполагает использование специального гомогенизатора высокого давления, способного проводить процесс при давлении до 2000 бар.
Технологической особенностью этого оборудования является наличие клапана с микрозазором, на который под высоким давлением и с низкой скоростью поступает негомогенизированный продукт. Это позволяет получить частицы микро и наноразмеров в зависимости от заданных параметров гомогенизации и свойств измельчаемого субстрата. Важнейшим итогом этого процесса является получение продукта, стандартизованного по физико-химическим параметрам (дзета-потенциал, размер и молекулярная масса частиц, коллоидная и термическая стабильность, химический состав) [10].
Материалы и методы исследования
В эксперименте воспроизведены основные этапы технологического процесса получения препарата «СТЭМБ» [3] и один цикл дополнительной гомогенизации при помощи лабораторного гомогенизатора высокого давления APV Lab Series Homogenizers 2000 при 1900 бар.
Определены физико-химические характеристики нового варианта препарата, в том числе дзета-потенциал, размер частиц образующих препарат, общее количество белка, РНК, ДНК и спектрофотометрический профиль, в сравнении с препаратом «СТЭМБ».
Для определения дзета-потенциала и размера частиц использовался анализатор Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, Великобритания), предоставленный научно-производственным объединением «СайТЭК» г. Ставрополь.
Для определения химического состава осуществляли:
1) количественную оценку содержания белков в образце методом специфической флуоресценции (флуориметр Qubit 2.0, Life Technologies, США);
2) количественную оценку содержания рибонуклеиновых кислот (РНК) в образце методом специфической флуоресценции (флуориметр Qubit 2.0, Life Technologies, США);
3) количественную оценку содержания дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК) в образце методом специфической флуоресценции (флуориметр Qubit 2.0, Life Technologies, США);
4) оценку характеристических спектров поглощения исследуемых образцов в диапазоне длин волн 190-840 нм (спектрофотометр NanoDrop 2000С, Thermo Fisher Scientific, США).
Результаты исследований
Биологически активный препарат, полученный с использованием гомогенизатора высокого давления, по сравнению с препаратом «СТЭМБ» приобрел признаки большей физической устойчивости. Кроме того, выявлено, что большинство частиц в препарате имеют диаметр ниже 100 nm и таким образом относятся к низкомолекулярным соединениям. Так, при применении НРН достоверно увеличилось количество общего белка, ДНК и в особенности РНК, соответственно на 71 мкг/мл (на 27,3 %), 0,34 мкг/мл (на 9,7 %) и 13,2 мкг/мл (на 194,1 %), что свидетельствует о более качественном разрушении клеточных структур и выходе в раствор биологически активных действующих веществ, обуславливающих биологическую активность препарата. Кроме того, расширение диапазона характеристических спектров вправо свидетельствует о качественном увеличении перечня БАВ в препарате, полученном с использованием HPH (табл. 1).
Таблица 1. Физико-химические свойства тканевого препарата, полученного с использованием HPH
Наименование показателя |
Характеристика препарата «СТЭМБ» (контроль) |
Характеристика препарата полученного с использованием HPH |
Внешний вид |
опалесцирующая жидкость желтоватого цвета с белым хлопьевидным осадком. |
опалесцирующая жидкость желтоватого цвета с небольшим количеством мелкозернистого осадка. |
Однородность препарата |
при встряхивании образуется взвесь быстро выпадающая в осадок. |
при встряхивании образуется однородная устойчивая взвесь. |
Дзета-потенциал |
минус 8,01 mV |
минус 8,20 mV |
Размер частиц (средний диаметр, nm - количество, %) |
35,13 d nm - 5,2 % 258,5 d nm - 80 % 2278 d nm - 14,7 % |
27,92 d nm - 12,0 % 82,31 d nm - 55 % 623,8 d nm - 32,9 % |
Общая концентрация белка, мкг/мл |
260,0 |
331,0 |
Общая концентрация ДНК, мкг/мл |
3,490 |
3,830 |
Общая концентрация РНК, мкг/мл |
6,80 |
20,00 |
Характеристический спектр поглощения в диапазоне длин волн 190-840 нм |
max 219 nm, 229 nm |
max 215 nm, 228 nm, 275 nm |
Заключение
Изменения в физико-химических параметрах неопровержимо свидетельствуют о том, что, несмотря на использование в обеих технологических схемах одной субстанции эмбрионального происхождения, применение технологии НРН обеспечивает получение качественно нового тканевого препарата.
Исследование проведено при финансовой поддержке Минобрнауки России, в рамках выполнения базовой части государственного задания (2014/2016).
Рецензенты:
Жарникова И.В., д.б.н., старший научный сотрудник, ведущий научный сотрудник научно-производственной лабораторией препаратов для диагностики особо опасных и других инфекций ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, г. Ставрополь.
Таран Т.В., д.м.н., старший научный сотрудник, заведующая лабораторией питательных сред для культивирования микроорганизмов 1-4 групп патогенности ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, г. Ставрополь.