Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,791

1,6-БИС[(БЕНЗИЛОКСИ)МЕТИЛ]ПРОИЗВОДНЫЕ УРАЦИЛА – НОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПТАЗЫ ВИЧ-1

Гейсман А.Н. 1 Валуев-Эллистон В.Т. 2 Новиков М.С. 1
1 ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет»
2 ФГБУН «Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН»
Производные 1,6-бис[(бензилокси)метил]замещенного урацила проявляют выраженную активность в отношении обратной транскриптазы (ОТ) – ключевого фермента ВИЧ – в микромолярном диапазоне концентраций. Обнаружено, что наличие ароматического радикала, связанного мостиковой цепочкой с атомом азота в положении 1 цикла урацила, является критическим для проявления активности в отношении ОТ. Среди синтезированных соединений обнаружены высокоактивные ингибиторы мутантных форм ОТ ВИЧ-1, превосходящие по активности используемый в практике препарат невирапин. Охарактеризованы закономерности «структура-активность» для синтезированных веществ. Для соединения-лидера серии – 6-[(бензилокси)метил]-1-[(3,5-дихлорбензилокси)метил]-урацила – осуществлен молекулярный докинг с использованием комплексов ОТ дикого типа ВИЧ-1 с известными ненуклеозидными ингибиторами, депонированных в Банке данных белков (PDB). Обнаружено, что исследуемое вещество способно к формированию водородных связей с аминокислотными остатками фермента в положениях 101 и 103, что играет важную роль в проявлении активности в отношении ОТ.
производные урацила
ВИЧ
обратная транскриптаза ВИЧ-1
ненуклеозидные ингибиторы
1. Синтез 1,6-бис[(бензилокси)метил]производных урацила и их 1-алкоксиметильных аналогов / А.Н. Гейсман [и др.] // Фундам. исслед. – 2013. – № 10-15. – С. 3477-3480.
2. Action of pancreatic DNase: requirements for activation of DNA as a template-primer for DNA polymerase / E. Baril [et al.] // Nucleic Acid Res. – 1977. – Vol. 4, № 8. – P. 2641-2654.
3. Crystal structures of HIV-1 reverse transcriptase with picomolar inhibitors reveal key interactions for drug design / K.M. Frey [et al.] // J. Am. Chem. Soc. – 2012. – Vol. 134, № 48. – P. 19501-19503.
4. Diphenyl ether non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors with excellent potency against resistant mutant viruses and promising pharmacokinetic properties / Z.K. Sweeney [et al.] // ChemMedChem. – 2009. – Vol. 4, № 1. – P. 88-99.
5. Discovery of 3-{5-[(6-amino-1H-pyrazolo[3,4-b]pyridine-3-yl)methoxy]-2-chloro-phenoxy}-5-chlorobenzonitrile (MK-4965): a potent, orally bioavailable HIV-1 non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor with improved potency against key mutant viruses / T.J. Tucker [et al.] // J. Med. Chem. – 2008. – Vol. 51, № 20. – P. 6503-6511.
6. Dixon M. The determination of enzyme inhibitor constant // Biochem. J. – 1953. – Vol. 55, № 1. – P. 170-171.
7. High potency improvements to weak aryl uracil HCV polymerase inhibitor leads / P. Donner [et al.] // Bioorg. Med. Chem. Lett. – 2013. – Vol. 23, № 15. – P. 4367–4369.
8. Picomolar inhibitors of HIV reverse transcriptase featuring bicyclic replacement of a cyanovinylphenyl group / W.-G. Lee [et al.] // J. Am. Chem. Soc. – 2013. – Vol. 135, № 44. – P. 16705-16713.
9. Structural basis for the improved drug resistance profile of new generation benzophenone non-nucleoside HIV-1 reverse transcriptase inhibitors / J. Ren [et al.] // J. Med. Chem. – 2008. – Vol. 51, № 16. – P. 5000-5008.

Введение

Диарилпроизводные пиримидиновых гетероциклов являются интересным классом органических соединений, обладающих биологической активностью различных типов. Среди них известно множество соединений, способных ингибировать репродукцию оболочечных вирусов, таких как вирус гепатита C [7] и в особенности вирус иммунодефицита человека (ВИЧ-1) [4; 8]. Одними из наиболее интересных объектов для введения ароматических остатков является урацил и его производные благодаря разнообразию синтетических методологий, позволяющих проводить их функционализацию.

Ранее нами был описан синтез производных урацила, содержащих ароматические фрагменты, связанные короткими мостиковыми фрагментами с гетероциклическим ядром в положениях 1 и 6 [1] (рис. 1).

Рисунок 1 – Общая структура 1,6-бис[(бензилокси)метил]производных урацила.

Целью настоящего исследования является изучение активности в отношении обратной транскриптазы ВИЧ-1 и ряда ее мутантных форм, содержащих аминокислотные замены в участке связывания ненуклеозидных ингибиторов, а также анализ закономерностей «структура-активность» в ряду 1,6-бис[(бензилокси)метил]производных урацила.

Материалы и методы

В работе использовались следующие материалы: [α-32P]dATP (5000 Ки/моль) фирмы «Изотоп» (Россия), 2`-дезоксирибонуклеозид–5’–трифосфаты (Promega, США), целлюлоз­ные фильтры Whatman 3MM (Whatman, Великобритания). Все остальные реактивы максимальной чистоты были приобретены у компаний Sigma-Aldrich или Fluka. Активи­рованная ДНК была получена из ДНК спермы лосося (Pharmacia Biotech, США) обработкой ДНКазой поджелудочной железы быка (Fermentas, Литва), как описано в работе [2].

Определение активности ОТ ВИЧ-1 в системе активированной ДНК. Стандартная реакционная смесь (20 мкл) содержала 150 мкг/мл активированной ДНК, 0,05 мкг ОТ ВИЧ-1, 3 мкМ ATP, по 30 мкМ остальных нуклеозид-5`-трифосфатов, 0,02 МБк [α-32P]dATP в буфере для измерения активности ОТ ВИЧ-1 (50 мМ Tрис•HCl, pH 8,1, 10 мМ MgCl2 и 200 мМ KCl). В экспериментах по исследованию ингибиторных свойств соединения вносили в реакционную смесь в виде растворов в диметилсульфоксиде до конечной концентрации последнего, равной 10%, при этом к контрольным реакциям прибавляли аналогичный объем чистого ДМСО. Реакцию инициировали прибавлением обратной транскриптазы и инкубировали в течение 20 мин при 37 °C, затем наносили пробы на фильтры (1x1 см) Whatman 3MM, пропитанные 1 мкл 0,5 M раствора ЭДТА. Фильтры отмывали от не включившегося в ДНК меченого нуклеотида 5 х 25 мл 10%-ной трихлоруксусной кислоты в течение 5 мин каждый, 25 мл этилового спирта и сушили на воздухе. Сорбированную на фильтрах радиоактивность измеряли по методу Черенкова в счетчике Intertechnique Liquid Scintillation Counter SL-4000. Расчет констант ингибирования проводили по методу Диксона для неконкурентного типа ингибирования [6].

Результаты и их обсуждение

Анализ результатов исследования биологической активности синтезированных соединений – 1,6-бис[(бензилокси)метил]производных урацила 1-14 и их N1-1-(3-метил­бутокси)метильных аналогов 15-16 позволил выявить закономерности «структура-активность» в данном ряду веществ. Наиболее активным в отношении обратной транскрип­тазы (ОТ) ВИЧ-1 дикого типа оказался 6-[(бензилокси)метил]-1-[(3,5-дихлорбензилокси)­метил]урацил (10), ингибировавший на 50% активность фермента в концентрации 0,62 μM и превосходивший «родоначальное» соединение ряда (1) по активности более, чем в два раза. Введение метильных заместителей в положения 3 и 5 цикла A (11), а также цианогруппы в положение 4 данного фрагмента (12) приводило к снижению активности, в то время как введение заместителей в положение 4 ароматического фрагмента B практически не оказывало значимого влияния на активность (2-3). Введение атомов галогенов в положение 5 гетероцикла (5-9) во всех случаях снижало активность по отношению к 5-незамещенным аналогам. Разветвленные [(1-фенилэтокси)метил]­производные (13-14) не проявили активности в отношении ОТ, а алифатические аналоги (15-16) показали на порядок более низкую активность, чем ароматические производные. Их константы ингибирования составили 33,4 и 50,4 μМ, соответственно (таблица 1).

Таблица 1 – Активность соединений 1-16 в отношении ОТ ВИЧ-1 дикого типа

1-14 15-16

Соед.

R1

R2

R3

R4

Ki (µМ)

1

H

H

H

H

1,4

2

4-Cl

H

H

H

1,66

3

4-CH3

H

H

H

2,13

4

3,5-Cl2

H

H

H

ND*

5

H

Cl

H

H

8,0

6

H

Br

H

H

15

7

4-Cl

Br

H

H

16,9

8

4-CH3

Br

H

H

12,9

9

H

I

H

H

8,43

10

H

H

3,5-Cl2

H

0,62

11

H

H

3,5-(CH3)2

H

1,67

12

H

H

4-CN

H

50

13

H

H

H

CH3

>100

14

4-Cl

H

H

CH3

>100

15

H

-

-

-

33,4

16

4-Cl

-

-

-

50,4

Невирапин

7,2

* активность не определена

Ki (константа ингибирования) – концентрация ненуклеозидного ингибитора обратной транскриптазы, обеспечивающая подавление активности фермента на 50%.

Анализ ингибиторной активности соединений 1-3 и 10-11 в отношении ряда мутантных форм ОТ показал, что исследуемые вещества оказываются на 1-2-порядка менее активными в отношении всех исследуемых типов фермента в сравнении с ОТ дикого типа. Исследованные вещества превосходили по активности используемый в клинической практике антиретровирусный препарат невирапин (Viramune®) в отношении одиночных мутантов и двойного мутанта K103N/Y181C, однако значительно уступали эфавиренцу по действию на те же формы ОТ. Наиболее благоприятный профиль резистентности по совокупности данных продемонстрировал 6-[(бензилокси)метил]-1-[(3,5-дихлорбензилокси)­метил]урацил (10). Интересной особенностью данного соединения явилась высокая активность в отношении ОТ с мутацией G190A, превышающая таковую для невирапина более чем в 217 раз. Следует также отметить, что наиболее выраженную активность в отношении одного из важнейших клинических одиночных мутантов вируса Y181C показало соединение 2, превышая эффективность невирапина более чем в 440 раз. Лидером по активности в отношении двойного мутантного изолята вируса K103N/Y181C стал 1-[(бензилокси)метил]-6-[(4-хлорбензилокси)метил]урацил (2) (таблица 2).

Таблица 2 – Активность соединений 1-3 и 10-11 в отношении мутантных вариантов ОТ ВИЧ-1

ОТ ВИЧ-1

1

2

3

10

11

Невирапин

Эфавиренц

Ki, μM

дикий тип

1,4

1,66

2,13

0,62

1,67

7,2

0,01

L100I

189

69

77

51

125

273

0,08

K103N

56

51

67

38

124

>2000

0,58

V106A

123

105

67

41

131

>2000

0,05

Y181C

60,6

4,5

10

26

109

>2000

0,03

G190A

>140

>166

>213

9,2

41

>2000

0,06

K103N/Y181C

>140

61

67

>62

>167

>2000

0,14

Ki (константа ингибирования) – концентрация ненуклеозидного ингибитора обратной транскриптазы, обеспечивающая подавление активности фермента на 50%.

Для рационализации полученных данных был проведен молекулярный докинг некоторых из полученных соединений в структуру комплексов ОТ с известными ННИОТ, депонированными в Банке данных белков (PDB-коды 3C6T и 4H4M) [3; 5]. Наибольшее отрицательное значение свободной энергии связывания лидера в ряду производных 1,6-бис[(бензилокси)метил]урацила (соединение 10) было достигнуто в случае комплекса 3С6T (исходный лиганд - 2-[3-хлор-5-(3-хлор-5-цианофенокси)фенокси]-N-(2-хлор-4-сульфамоил-фенил)ацетамид). Обнаружено близкое соответствие расположения 3,5-дихлорбензильного фрагмента соединения 10 и цикла А исходного диарилэфирного ННИОТ. Согласно результатам докинга, данный фрагмент образует π-стэкинг-взаимодействия с остатками аминокислот Y181, Y188 и W229. Благоприятный эффект от введения мета-заместителей на ингибирование активности фермента может быть связан с продвижением цикла А глубже в область гидрофобного кармана, формируемую ароматическими аминокислотными остатками, а также образованием дополнительных Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий с остатками L234 и F227 [5; 9]. Отрицательное влияние атомов галогенов в положении 5 на активность может объясняться электростатическим отталкиванием между ними и атомом кислорода мостиковой цепочки в положении 6, приводящем к изменению оптимальной конформации последней. Атом кислорода амидной группы остатка урацила способен к формированию водородной связи с NH-фрагментом остатка K103, при этом расстояние между центрами атомов О и N оценивается в 3,2 Å, что несколько больше (2,8 Å) расстояния между атомом кислорода карбонильной группой оксиацетамидного фрагмента модельного ингибитора и атомом азота в том же аминокислотном остатке фермента, однако не превышает дистанцию Ван-дер-Ваальса. Согласно результатам докинга, возможно также формирование дополнительной водородной связи между атомом азота в амидном фрагменте урацила (N3) и амидным функцией остатка K101 (рисунок 2).

Рисунок 2 – Возможная конформация

6-[(бензилокси)метил]-1-[(3,5-дихлорбензилокси)метил]урацила (10, выделен красным) в наложении с диарилэфирным ННИОТ (PDB-код 3C6T, выделен зеленым) в аллостерическом сайте ОТ дикого типа ВИЧ-1

Выводы

Среди производных 1,6-бис[(бензилокси)метил]урацила были обнаружены высокоактивные ингибиторы обратной транскриптазы ВИЧ-1, проявляющие активность на субмикромолярном уровне. Полученные соединения являются перспективными для дальнейшего изучения и внедрения в практику.

Настоящая работа выполнена при поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований (№ 13-04-01391).

Рецензенты:

Ганичева Л.М., д.фарм.н., доцент кафедры управления и экономики фармации, медицинского и фармацевтического товароведения Волгоградского государственного медицинского университета, г. Волгоград.

Симонян А.В., д.фарм.н., профессор кафедры фармацевтической технологии и биотехнологии Волгоградского государственного медицинского университета, г. Волгоград.


Библиографическая ссылка

Гейсман А.Н., Валуев-Эллистон В.Т., Новиков М.С. 1,6-БИС[(БЕНЗИЛОКСИ)МЕТИЛ]ПРОИЗВОДНЫЕ УРАЦИЛА – НОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПТАЗЫ ВИЧ-1 // Современные проблемы науки и образования. – 2014. – № 3.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=13545 (дата обращения: 17.11.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074