Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ЖИВЫХ КЛЕТОК ОПУХОЛИ ПЛОСКОГО ЭПИТЕЛИЯ ДО И ПОСЛЕ ХИМИОЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИИ У БОЛЬНЫХ ПЛОСКОКЛЕТОЧНЫМ РАКОМ ПОЛОСТИ РТА

Розенко Л.Я. 1 Тарнопольская О.В. 1 Шихлярова А.И. 1 Непомнящая Е.М. 1 Крохмаль Ю.Н. 1
1 ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский институт» Минздрава России
Методом флуоресцентной микроскопии исследовали интенсивность флуоресценции витальных красителей ДСМ (4-(n-диметиламиностирил)-1- метилпиридиний), АНС и доксорубицина (ДР), связанных с клетками опухоли плоскоклеточного рака полости рта человека, лейкоцитами, населяющими опухоль до и после химиолучевого лечения. Химиотерапия с цисплатином проводилась под ультразвуковым воздействием. Для клеток, окрашенных ДСМ, получены статистически значимые различия в средней интенсивности флуоресценции опухолевых клеток в группах больных до и после лечения (р=0,038), снижение интенсивности в 1,7 раза. Это свидетельствуют о том, что показатели флуорохрома ДСМ, связанного с опухолевыми клетками, отражают результаты лечения, могут быть критерием наличия в клетках цисплатина. Для клеток в окраске доксорубицина и АНС от больных до и после лечения значимых различий по интенсивности не выявлено. В окраске АНС хорошо визуализируются живые и мертвые клетки, а в окраске ДР визуализировано преимущественное накопление ДР в ядрах клеток.
доксорубицин.
флуоресцентные зонды АНС и ДСМ
химиолучевая терапия
плоскоклеточный рак полости рта
1. Андронова Н.В. [и др.] Концепция использования в онкологии ультразвукового воздействия средней интенсивности в сочетании с химиотерапией // Медицинская физика. – 2010. – № 3. – С. 12-17.
2. Гинзбург Г.А. [и др.] Рак слизистой оболочки полости рта – две стороны одной проблемы // Сибирский онкологический журнал. – 2010. – № 3 (39). – С. 61.
3. Максимов Г.К. [и др.] Неоднородность клеток эпителия пунктата аденокарциномы предстательной железы по мембранному потенциалу // Вестник Южного научного центра РАН. - 2012. – Т. 8, № 3. - С. 55-60.
4. Непомнящая Е.М. Тарнопольская О.В., Мамулян Х.Г. Прижизненная флуориметрия клеток перстневидноклеточного рака желудка с применением флуорохромов АНС и ДСМ // Клиническая и экспериментальная морфология. – 2012, № 4. - С. 18-22.
5. Способ лечения рака языка : патент № 2488412 РФ от 03.02.2012; опубл. 27.07.2013; Бюл. № 21; Авторы: Кит Олег Иванович (RU), Джабаров Фархад Расимович (RU), Франциянц Елена Михайловна (RU), Розенко Любовь Яковлевна (RU), Максимов Алексей Юрьевич (RU), Крохмаль Юлия Николаевна (RU).
6. Тарнопольская О.В. [и др.] Возможность определения цисплатина в клетках опухоли по флуоресценции АНС и ДСМ // Клиническая и экспериментальная морфология. – 2013. - № 2. - С. 57-61.
7. Тарнопольская О.В., Непомнящая Е.М., Горностаев А.С. Мембранный потенциал клеток аденокарциномы поджелудочной железы и накопление ими цитостатика доксорубицина // Тезисы симпозиума «Проблемы медицинской биофизики»; Факультет фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова, 14-15 сентября 2012 г. – М. : МАКС Пресс, 2012. - С. 117-118.
8. Тарнопольская О.В., Непомнящая Е.М., Сергань В.А. Визуализация взаимодействия цефалоспоринов с клетками эпителия аденокарциномы предстательной железы с помощью окрашивания витальным флуоресцентным красителем ДСМ // Новости клинической цитологии России. – 2012. – Т. 16, № 1-2. - С. 10-11.
9. Шихлярова А.И. [и др.] Особенности накопления флуорохромов АНС, ДСМ и доксорубицина в клетках саркомы 45 крыс при действии на опухоль in vivo магнитным полем // Клиническая и экспериментальная морфология. – 2013. - Т. 7, № 3. - С. 44-48.
10. Kim H.J., Greenleaf J.F., Kinnick R.R. et al. Ultrasound-mediated transfection of mammalian cells. // Hum. Gen. Ther. – 1996. – 7. - P. 1939-1946.

Введение. Основным методом лечения местно распространенных процессов плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта (ПРСПР) является лучевая терапия, при проведении которой число рецидивов достигает 50% случаев (Г.А. Гинзбург и соавт.) [2].

Сонодинамическая терапия с помощью локального ультразвука средней интенсивности в сочетании с химиотерапией и/или соносенсибилизатором позволяет увеличить биодоступность лечебных препаратов к опухоли, усилить повреждающее действие на опухоль (Андронова Н.В. и соавт.) [1]; Kim H.J. et al. [10]. Однако еще не доказаны механизмы взаимодействия с клеточными структурами цитостатиков, введенных в ткани с помощью ультразвукового воздействия.

Изучение электрической неоднородности клеточной взвеси, обусловленной различной величиной мембранных потенциалов живых клеток, способствует пониманию взаимодействия этих клеток с разными ионами (например, цитостатиками, антибиотиками), а также оценке влияния и действия на клетки электромагнитных полей и радиации. Высокие потенциальные возможности использования потенциалозависимых флуорохромов АНС и ДСМ были доказаны в работах О.В. Тарнопольской (2012) [6-8]; Г.К. Максимова (2012) [3], Е.М. Непомнящей (2012) [4], А.И. Шихляровой (2013) [9].

Цель. Изучить изменения, происходящие в опухолевых клетках больных (ПРСПР) при химиолучевом лечении с использованием локальной УЗ-химиотерапии.

Материалы и методы. Изучали опухолевые клетки биоптатов 11 больных 3-4 стадии ПРСПР, получавших расщепленным курсом ДГТ в режиме ускоренного фракционирования (1,2+1,2 Гр с интервалом 5 часов) и локальную химиотерапию цисплатином, проводимую в интервале между отдельными фракциями разовой дозы с использованием УЗ-воздействия (патент № 2488412 от 03.02.2012) [5]. Исследовали биопсийный материал до лечения и после очаговой дозы 40 Гр и суммарной дозы цитостатика 45 мг.

Из биоптата ПРСПР, не более 30 мин после удаления, размером 3×4 мм, получали клеточную взвесь путем измельчения скальпелем на стекле в 100 мкл забуференного физраствора. Концентрация клеток в ней составляла 5±3×104 клеток. Каждую клеточную взвесь от одного больного делили на три части. Одну часть витально окрашивали флуорохромом АНС, вторую - ДР, третью - ДСМ. Флуоресцентный зонд-катион ДСМ использовали в конечной концентрации 20 мкМ, АНС – 40 мкМ, ДР – 50 мкМ. Препараты живых клеток после 10-20 минутной инкубации с флуорохромами при температуре 22-25 °С под покровным стеклом исследовали под микроскопом Axio Imager M2, Zeiss. Захват изображения (модуль MosaiX) производили цветной цифровой камерой AxioCam HRc, а интерактивные измерения проводили с помощью программного обеспечения AxioVision, rel.4.8., измеряя в среднем до 100 клеток опухоли в каждой пробе и все попавшие при этом в поле зрения лейкоциты, в основном сегментоядерные нейтрофилы и лимфоциты. Флуорохром ДСМ был синтезирован в НИИ физической и органической химии при ЮФУ. АНС был поставлен фирмой Serva. Длина волны возбуждения и ДСМ, и ДР составляла 480 нм, а волны эмиссии - 520 нм. Для АНС эти параметры – 375 и 480 нм. При микросъемке строго соблюдали одинаковое разрешение и экспозицию для каждого флуорохрома в сравниваемых пробах для обеих групп (до и после лечения). Данные измерений клеток сохраняли в приложении AxioVision, rel.4.8 в файле, совместимом с Excel (Microsoft Office-2003), которые затем сводили в общие электронные таблицы и статистически обрабатывали с помощью Statistika 6.0. Клетки опухоли измеряли одним инструментом – «Outline», а лейкоциты – другим: «Circle Out-In», массив показателей сортировали по инструменту измерения, и тем самым отделяли показатели клеток опухоли от лейкоцитов. Яркость клеток суммировали по трем каналам (RGB). Для оценки различий (р-уровень) применяли как параметрические показатели (среднее и стандартное отклонение, t-test Стьюдента), так и непараметрические – критерий Вилкоксона.

Результаты. Флуорохром-анион АНС окрашивает живые клетки голубым свечением, концентрируется на мембране, не проникает в ядро, поскольку мембрана ядра заряжена отрицательно и в силу этого не пропускает анион АНС. Если в данной окраске ядро прокрашено и светит ярче цитоплазмы, то эта клетка мертвая [9]. На рис. 1 (А, Б, В, Г, Д) показаны поля зрения клеточной взвеси ПРСПР, окрашенные АНС. На рис. 2 и 3 живые клетки в окраске ДСМ и ДР, соответственно. Флуорохромы-катионы легко проникают в ядра клеток, делая ядро зачастую ярче цитоплазмы.

Рис. 1 (А, Б, В, Г, Д). Поля зрения препарата клеточной взвеси плоскоклеточного рака полости рта человека, окраска АНС. Имеет место клеточный и ядерный полиморфизм. Видим неоднородность по яркости флуоресценции АНС, связанного с клетками. Л – лейкоциты (клетки биоптата больных до лечения).

Рис. 2 (А, Б, В, Г). Поля зрения препарата клеточной взвеси ПРСПР, флуорохром ДСМ. После лечения. В данном случае ядра плохо прокрашены по сравнению с оранжевыми ядрами клеток аденокарциномы предстательной железы [6].

Рис. 3 (А, Б, В, Г). Поля зрения препарата клеточной взвеси ПРСПР, флуорохром доксорубицин. Больные после лечения. Л – лейкоциты. Ядра клеток интенсивно набрали доксорубицин.

В таблице 1 представлены полученные цитометрические результаты для группы 1 – «До лечения», а в таблице 2 - для группы 2 «После лечения», окраска ДСМ. Измеряли размеры клеток и яркость флуоресценции. Такие же таблицы были созданы для флуорохромов АНС и ДР. В таблицу 3 сведены данные по средним для групп значениям цитометрических показателей для трех флуорохромов; представлен уровень статистической значимости различий между группами «р», рассчитанный по критерию Стьюдента (параметрический) и по критерию Вилкоксона (непараметрический).

Таблица 1. Цитометрические показатели клеток опухоли ПРСПР больных ДО лечения. Флуорохром ДСМ.

Группа 1, больные до лечения (n=11)

Номер больного

Клетки опухоли

Лейкоциты в опухоли

N

S± ст. откл. (мкр кв.)

Br ± ст. откл. (отн. ед.)

Nlе

Dle± ст. откл.

Brle ± ст. откл.

1

116

199±119

39±7

58

8,6±1,8

73±36

2

82

134±62

42±7

77

8,6±1,1

45±7

3

118

232±126

86±36

61

9,2±2,9

82±35

4

60

156±73

21±6

29

8,5±1,4

24±9

5

70

363±216

52±2

88

8,1±1,2

18±2

6

96

412±242

45±11

65

9,8±1,3

57±30

7

97

212±90

25±12

66

8,8±1,4

27±10

8

98

302±104

42±10

67

8,6±1,5

50±22

9

99

286±145

12±4

68

9,0±1,6

22±13

10

75

187±140

32±15

42

9,1±1,5

28±14

11

85

296±147

44±16

24

8,0±1,8

42±15

СРЕДНЕЕ →

253±87

40±19

 

8,8±0,5

42±22

Таблица 2. Цитометрические показатели клеток опухоли ПРСПР больных ПОСЛЕ лечения. Флуорохром ДСМ.

Номер больного

Клетки опухоли

Лейкоциты в опухоли

N

S (мкр кв.)

Br (отн. ед.)

Nlе

Dle± ст. откл.

Brle (отн. ед.)

1

131

214±91

40±16

33

8,7±1,7

23±5

2

50

156±73

21±6

29

8,5±1,4

24±9

3

60

363±216

12±2

40

8,1±1,2

14±2

4

96

402±142

25±11

15

9,8±1,3

35±10

5

48

452±400

20±12

45

9,3±1,3

15±4

6

94

144±69

27±4

26

7,2±0,9

37±7

7

95

194±70

15±5

27

7,2±1,0

20±9

8

96

294±71

35±9

19

9,2±1,1

29±10

9

97

280±72

24±12

27

8,2±1,2

23±6

СРЕДНЕЕ →

277±110

24±9

 

8,5±0,9

24±8

Таблица 3. Сравнение средних цитометрических показателей клеток опухоли плоскоклеточного рака слизистой полости рта (ПРСПР) и лейкоцитов, населяющих эту опухоль. Уровни статистического различия между ними.

Флуорохром

Цитометрический показатель

Больные ДО ЛЕЧЕНИЯ

Больные ПОСЛЕ ЛЕЧЕНИЯ

р-уровень (Т-Тест Стьюдента)

р-уровень (Wilcoxon-test),

ДСМ

(S), мкр кв.

253±87

277±110

р=0,577

р=0,441

Яркость (Br), отн. ед.

40±19

24±9

р=0,038

р=0,086

(D le), мкр

8,8±0,5

8,5±0,9

р=0,380

р=0,554

Яркость (Brle), отн. ед.

42±22

24±8

р=0,030

р=0,038

АНС

(S), мкр кв.

227±61

210±44

р=0,499

р=0,953

Яркость (Br), отн. ед.

71±28

61±10

р=0,349

р=0,678

(D le), мкр

8,6±1,1

7,7±0,5

р=0,037

р=0,0,21

Яркость (Brle), отн. ед.

37±10

44±10

р=0,164

р=0,173

ДР

(S), мкр кв.

248±83

292±106

р=0,308

р=0,374

Яркость (Br), отн. ед.

31±8

30±10

р=0,855

р=0,859

(D le), мкр

8,7±0,5

8,8±0,7

р=0,629

р=0,753

Яркость (Brle), отн. ед.

36±13

30±12

р=0,255

р=0,441

Обозначения в таблицах: S - средняя площадь клеток; Dle - средний диаметр лейкоцитов; Br - средняя яркость клеток; N - число измеренных клеток; ст. откл. - стандартное отклонение; мкр кв. - микрон квадратный; отн. ед. - относительные единицы. На рис. 4 представлены графики средних значений измеренных показателей (Mean) и стандарнтой ошибки среднего (±SE) для клеток, окрашенных АНС и ДСМ.

Рис. 4. Разброс флуориметрических показателей клеток ПРСПР у больных до и после лечения.

Обсуждение. Визуализация клеточной взвеси ПРСПР, окрашенной витальными флуорохромами, показывает четкую картину неоднородности по яркости клеток опухоли и лейкоцитов, так же как на других типах опухолевых клеток, о чем сообщалось в работах [3; 4]. Об этом свидетельствуют представленные здесь таблицы и рис. 4. Нами были обнаружены различия в выбранных флуориметрических показателях между группами до и после лечения. Это достоверная разница в средней яркости флуоресценции ДСМ, которая в группе больных после лечения снижена в 1,7 раза (р=0,038). Яркость флуоресценции АНС, связанного с опухолевыми клетками, также несколько снижена у больных после лечения, но не достоверно. На основании исследования, представленного в работе [8], можно объяснить происхождение такого различия. Все больные второй группы получали цисплатин при химиотерапии, а вывод в работе [8] свидетельствует о конкуренции в ядре клеток между ДСМ и цисплатином. Цисплатин занимает места связывания в ядре и не позволяет связаться там молекулам ДСМ, а без этой связи флуоресценции ДСМ не происходит. Отсюда и пониженная яркость целых клеток, и сниженная яркость ДСМ в ядрах этих клеток, например на рис. 2 (Б). Остальные показатели на данном числе испытаний не представили значимой разницы. Можем отметить следующие различия в клеточных картинах ПРСПР в группах до и после лечения: во-первых, до лечения имеет место обилие флоры, расположенной на плоских клетках, да и самой взвеси (рис. 1). После лечения флоры практически нет; во-вторых, имеет место значительное преобладание плоских клеток у больных после лечения, рис. 3.

Выводы. Полученные данные свидетельствуют о том, что снижение яркости флуоресценции ДСМ, связанного с опухолевыми клетками, может быть критерием наличия в клеточной взвеси цисплатина.

Рецензенты:

Каймакчи О.Ю., д.м.н., ассистент кафедры онкологии Ростовского государственного медицинского университета, г. Ростов-на-Дону.

Николаева Н.В., д.м.н., ассистент кафедры онкологии Ростовского государственного медицинского университета, г. Ростов-на-Дону.


Библиографическая ссылка

Розенко Л.Я., Тарнопольская О.В., Шихлярова А.И., Непомнящая Е.М., Крохмаль Ю.Н. ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ЖИВЫХ КЛЕТОК ОПУХОЛИ ПЛОСКОГО ЭПИТЕЛИЯ ДО И ПОСЛЕ ХИМИОЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИИ У БОЛЬНЫХ ПЛОСКОКЛЕТОЧНЫМ РАКОМ ПОЛОСТИ РТА // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 6. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=11699 (дата обращения: 01.12.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074