Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,791

ПУТИ РЕАЛИЗАЦИИ ДИСТАНТНОГО ИШЕМИЧЕСКОГО ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ И ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ НИКОРАНДИЛОМ ПРИ L-NAME ИНДУЦИРОВАННОМ ДЕФИЦИТЕ ОКСИДА АЗОТА

Даниленко Л.М. 1
1 ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»
В ходе проведенного исследования установлено, что индуцибельная NO-синтаза и АТФ-зависимые калиевые каналы (КАТФ) играют важную роль в формировании эндотелиопротекторного эффекта как дистантного ишемического прекондиционирования, так и фармакологического. Селективный блокатор индуцибельной NO-синтазы, аминогуанидин в дозе 100 мг/кг, полностью устранял эндотелиопротекторный эффект дистантного ишемического прекондиционирования, в группе с применением никорандила полной отмены эффекта прекондиционирования не произошло. Глибенкламид в дозе 4 мг/кг, блокатор КАТФ, нивелировал эндотелиопротекторные эффекты как дистантного ишемического прекондиционирования, так и фармакологического прекондиционирования никорандилом. Что выразилось в повышении коэффициента эндотелиальной дисфункции до значений, близких к группе с введением L-NAME. Представленные результаты исследований указывают на наличие у никорандила и дистантного ишемического прекондиционирования эффекта прекондиционирования посредством активации КАТФ-каналов. Эти данные подтверждают концепцию, что эндотелиопротекторное действие ишемического и фармакологического прекондиционирования можно моделировать через КАТФ, предполагая, что активация этих каналов может быть эффективным средством улучшения состояния эндотелия и профилактикой сердечно-сосудистых осложнений.
дистантное ишемическое прекондиционирование.
КАТФ
эндотелий
никорандил
1. Бокерия JI.A., Чичерин И.Н. Природа и клиническое значение «новых ишемических синдромов». – М. : НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН. – 2007. – С. 302.
2. Aird W.C. Mechanisms of endothelial cell heterogeneity in health and disease // Circ. Res. – 2006. – Vol. 98, № 2. – P. 159-162.
3. Dirnagl U., Simon R.P., Hallenbeck J.M. Ischemic tolerance and endogenous neuroprotection // Trends Neurosci. – 2003. – Vol. 26, № 5. – P. 248-254.
4. Domenech R.J., Macho P. Cardiovascular aging // Rev Med Chil. – 2008. – Vol. 136, № 12. – P. 1582-1588.
5. Downey J.M., Davis A.M., Cohen M.V. Signaling pathways in ischemic preconditioning // Heart. Fail. Rev. – 2007. – Vol. 12, № 3-4. – P. 181-188.
6. Cardioprotective effect of resveratrol, a natural antioxidant derived from grapes / L. Hung, J. Chen, S.S. Huang et al. // Cardiovasc. Res. – 2000. – Vol. 47, № 3. – P. 549-555.
7. Jager U., Nguyen-Duong H. Relaxant effect of trans-resveratrol on isolated porcine coronary arteries // Arzneimittelforschung. – 1999. – Vol. 49, № 3. – P. 207-211.
8. Ischemic preconditioning does not improve myocardial preservation during off-pump multivessel coronary operation / H.J. Penttild, M.V. Lepojarvi, P.K. Kaukoranta et al. // Ann Thorac Surg. – 2003. – Vol. 75, № 4. – P. 1246-1252.
9. Expression of hypoxia inducible factor 1 in the brain of rats during chronic hy-poxia / J.C. Chavez, F. Agani, P. Pichiule et al. // J. Appl. Physiol. – 2000. – Vol. 89, № 5. – P. 1937-1942.
10. Renal Anaemia Treatment with Recombinant Human Erythropoietin Increases Cardiac Output in Patients with Ischaemic Heart Disease / T. Linde, B. Wikstrom, L.G. Andersson et al. // Scand. J. Urol. Nephrol. – 1996. – Vol. 30, № 2. – P 115-120.

Введение

Исследования последних десятилетий в области ишемических кардиальных катастроф подчеркивают важную роль эндотелия сосудов. Безусловно, что наряду с протекцией миокарда важное клиническое значение имеет защита клеток эндотелия, так как ишемия и последующая реперфузия приводят к эндотелиальной дисфункции [9] и определяют степень повреждения миокарда [10]. Особенно эта проблема актуальна для пожилых пациентов, поскольку с увеличением возраста наблюдается прогрессирование дисфункции эндотелия и повышение риска развития сердечно-сосудистых осложнений [7; 8]. Данные ряда исследовательских работ подтверждают тот факт, что состояние, характеризующееся нарушенной функцией эндотелия, обратимо [4]. В связи с этим поиск путей эндотелиопротекции продолжается. В ряде работ отмечается, что ишемическое прекондиционирование (ИП) способствует уменьшению дисфункции эндотелиальных клеток коронарных артерий [6]. Ишемическое прекондиционирование может рассматриваться как неспецифический ответ на различные ви­ды сублетального стресса. С практической точки зрения предпочтение видится в использовании медикаментозных, фармакологических агентов прекондиционирования, так как это дает возможность контролировать их дозы, пролонгировать эффект, снижать развитие толерантности.

Никорандил - уникальный фармакологический препарат, обладающий свойствами открывать аденозинтрифосфатзависимые калиевые (КАТФ) каналы и активировать систему синтеза оксида азота (NO).

В механизм ишемического прекондиционирования вовлечено несколько ключевых медиаторов, включая аденозин, сублетальные активные формы кислорода (ROS) и NO. Никорандил открывает митохондриальные КАТФ-каналы не только прямым воздействием, но и опосредованно, через активацию пути NO – ц ГМФ-зависимой протеинкиназы .

В связи с этим целью нашего исследования является изучение механизмов реализации эндотелиопротекторных эффектов дистантного ишемического прекондиционирования и фармакологического прекондиционирования никорандилом при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота.

Материалы и методы

Моделирование L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции проводили на белых крысах-самцах линии Wistar массой 250-300 г. Все исследования проводили в одно и то же время суток во второй половине дня. N-нитро-L-аргинин метиловый эфир (L-NAME) вводили ежедневно один раз в сутки внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг в течение 7 дней.

Развитие эндотелиальной дисфункции (ЭД) оценивали путем проведения пробы на эндотелийзависимую вазодилатацию (ЭЗВД) в ответ на болюсное внутривенное введение раствора ацетилхолина в дозе 40 мкг/кг и эндотелийнезависимую вазодилатацию (ЭНВД) в ответ на болюсное введение раствора нитропруссида натрия в дозе 30 мкг/кг. Для объективной оценки развития нарушения функции эндотелия рассчитывали коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД). Для этого определяли площади прямоугольных треугольников над кривыми восстановления микроциркуляции после проведения реакций ЭЗВД и ЭНВД. КЭД рассчитывался как отношение площади треугольника над кривой восстановления микроциркуляции в ответ на введение нитропруссида к площади треугольника над кривой восстановления микроциркуляции в ответ на введение ацетилхолина [5].

Биохимическими маркерами эндотелиальной дисфункции служили Total NO (NOx). Нами использована модификация метода определения стабильных метаболитов NO. Принцип метода заключается в одновременном восстановлении нитратов в нитриты в присутствии хлористого ванадия и реакции диазотирования с последующим развитием окраски.

Для морфологического подтверждения развития моделируемых патологических процессов кусочки органов фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине и заливали в парафин по общепринятым методикам (Меркулов Г.А., 1969). В почках обращали внимание на состояние капилляров клубочков, толщину стенок артерий и артериол и их эндотелия. В сердце изучали общее состояние эндокарда и перикарда, кардиомиоцитов и стромы, оценивали состояние сосудов миокарда и их эндотелия.

Дистантное ишемическое прекондиционирование создавали по ранее апробированной и обоснованной методике наложением эластичного жгута на верхнюю треть контрлатерального (правого) бедра на 10 минут с последующей 20-минутной реперфузией непосредственно перед моделированием патологии. Контролем эффективности пережатия служило исчезновение пульсации на артериях стопы и появление цианоза ее кожи в первые секунды после наложения жгута.

Никорандил вводили в дозе 2 мг/кг в виде раствора внутрижелудочно через зонд 2 раза в сутки в течение 7 дней непосредственно перед введением L-NAME.

Для изучения участия АТФ-зависимых калиевых каналов и индуцибельной NO- синтазы в реализации эндотелиопротекторных эффектов различных форм прекондиционирования использовали глибенкламид в дозе 0,4 мг/кг, который вводили внутрибрюшинно 1 раз в сутки в течение 7 дней на фоне введения L-NAME и аминогуанидин в дозе 100 мг/кг.

Статистический анализ полученных данных осуществляли в программе Microsoft Excel. «Описательная статистика» применялась для нахождения среднего значения (M) и ошибки среднего (m). «Двухвыборочный t-тест с различными дисперсиями» использовался для сравнения показателей в различных группах животных и определения достоверности различий между ними. Статистически значимыми считали различия при значениях двустороннего p<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Проведенные нами исследования показали, что и дистантное, и фармакологическое прекондиционирование никорандилом оказывают выраженное эндотелиопротекторное действие, выражающееся в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции. Так, КЭД в группах животных с применением фармакологического прекондиционирования никорандилом составил 1,9±0,18 усл. ед., дистантного ишемического прекондиционирования – 2,5±0,3 усл. ед. по сравнению с группой контроля L-NAME-патологии – 5,4±0,6 усл. ед.

NO-продуцирующая функция эндотелия исследована нами на основании определения в сыворотке крови концентрации конечных стабильных метаболитов оксида азота (NOх). Концентрация NOх на фоне дистантного и фармакологического прекондиционирования увеличивалась, приближаясь к уровню интактных животных (7,3±0,73 мкмоль/л), и составила 4,8±0,25 мкмоль/л, 6,2±0,3 мкмоль/л при проведении прекондиционирования ДИП и никорандилом соответственно.

Данные морфологических исследований показали, что применение двух видов прекондиционирования положительно повлияло на морфологические изменения почек и сердца крыс с экспериментальной артериальной гипертензией. Так, в группе с ДИП эта величина равнялась 13,0±0,5 мкм, и 12,0±0,3 мкм в группе с использованием никорандила. Отмечались нормализация структуры капилляров, предотвращение развития гипертрофических изменений диаметра кардиомиоцитов, отсутствовали деструктивные изменения эндотелия сосудов и признаки гипертрофии их стенок. В почках почти полностью исчезли признаки мембранозной гломерулопатии и капилляры клубочков выглядели в большинстве случаев так же, как и у интактных животных. Размер диаметра кардиомиоцитов группе контроля составил 18,5±0,3 мкм (рис. 1).

А  Б  В

Рисунок 1. А-Крыса с экспериментальной артериальной гипертензией: клубочки имеют «лапчатые» очертания; базальные мембраны капилляров утолщены («проволочные петли»). Почка крысы на фоне проведения ДИП (Б) прекондиционирования никорандилом (В). 8-е сутки эксперимента: капилляры клубочка почки без патологических изменений; артериола коркового вещества без признаков гипертрофии, эндотелий не поражен. Окраска гематоксилином и эозином. Микрофото. х 400.

Таким образом, мы можем заключить, что и ДИП, и фармакологическое прекондиционирование никорандилом в эксперименте оказывают эндотелиопротекторное действие на L-NAME-индуцированной модели дефицита оксида азота.

Для изучения роли АТФ-зависимых калиевых каналов и индуцибельной NO-синтазы в эндотелиопротекторных эффектах разных видов прекондиционирования нами были выполнены следующие эксперименты:

1) группа интактная;

2) группа контроля на фоне L-NAME-патологии;

3) L-NAME+ на фоне дистантного ишемического прекондиционирования (ДИП);

4) L-NAME + на фоне введения никорандила (фармакологическое прекондиционирование);

5) L-NAME+ на фоне введения глибенкламида;

6) L-NAME+ на фоне введения аминогуанидина;

7) L-NAME+ на фоне проведения ДИП, после предварительного введения глибенкламида;

8) L-NAME+ на фоне введения никорандила, после предварительного введения глибенкламида;

9) L-NAME+ на фоне проведения ДИП, после предварительного введения аминогуанидина;

10) L-NAME+ на фоне введения никорандила, после предварительного введения аминогуанидина.

Таблица 1.

Влияние дистантного ишемического прекондиционирования и фармакологического прекондиционирования никорандилом на коэффициент эндотелиальной дисфункции при моделировании L-NAME (25 мг/кг внутрибрюшинно, однократно в течение 7 дней) индуцированного дефицита оксида азота (M±m, n=10)

№ n/n

Группа

КЭД (усл. ед.)

NOx (мкмоль/л)

ДКМЦ (мкм)

1.

Интактные

1,1±0,1 *

7,7±0,2*

9,1±0,4*

2.

Контроль

5,4±0,5

2,3±0,4

18,5±0,1

3.

L-NAME+ДИП

2,5±0,3*

4,8±0,3*

13,0±0,6*

4.

L-NAME +никорандил

1,9±0,1*

6,2±0,6*

12,0±0,3*

5.

L-NAME+аминогуанидин

4,8±0,2

2,6±0,3

16,4±0,4

6.

L-NAME+глибенкламид

5,3±0,5

2,2±0,2

18,1±0,3

7.

L-NAME+аминогуанидин +ДИП

5,1±0,2

3,1±0,4

17,3±0,1

8.

L-NAME+аминогуанидин никорандил

2,3±0,4*

6,0±0,3*

10,5±0,5*

9.

L-NAME+глибенкламид +ДИП

4,4±0,3

3,5±0,5

17,0±0,4

10.

L-NAME+глибенкламид +никорандил

4,3±0,5

3,0±0,2

17,1±0,2

Примечание: * – р<0,05 в сравнении с L-NAME,

NOx - концентрация конечных стабильных метаболитов оксида азота, ДКМЦ – диаметр кардиомиоцитов, КЭД – коэффициент эндотелиальной дисфункции.

Введение аминогуанидина животным контрольной группы не повлияло на КЭД и составило 4,8±0,2 усл. ед., что достоверно не отличается от группы контроля. Введение его перед применением дистантного ишемического прекондиционирования увеличивало КЭД (таблица 1) и нивелировало эндотелиопротекторный эффект дистантного ишемического прекондиционирования. В группе с применением аминогуанидина с никорандилом полной отмены эффекта прекондиционирования не произошло, отмечено лишь небольшое его уменьшение. Что в цифрах составляет 2,3±0,4 усл. ед. Что подтверждается и результатами биохимических и морфологических исследований (таблица 1).

Введение глибенкламида, блокатора АТФ-зависимых калиевых каналов полностью нивелировали эндотелиопротективные эффекты всех способов прекондиционирования: и ишемического, и фармакологического, что выражалось в повышении коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), при этом значения приближались к таковым в группе с L-NAME-патологией (5,4±0,6 усл. ед.) и составили 4,4±0,5 усл. ед. и 4,3±0,2 усл. ед. при введении глибенкламида на фоне прекондиционирования ДИП и никорандила. Что подтверждается результатами биохимических и фармакологических исследований (таблица 1).

В настоящее время не существует фармакологической группы для специфической коррекции эндотелиальной дисфункции, поэтому данные о свойствах различных препаратов и кардиологических феноменов в качестве дополнения к существующим методам лечения сердечно-сосудистых заболеваний имеют огромное значение.

В исследованиях, проведенных в нашей лаборатории ранее, показано положительное влияние дистантного ишемического прекондиционирования и фармакологического прекондиционирования на степень выживаемости ишемизированных тканей и неоваскулогенез, воспалительный процесс и размер повреждения миокарда при инфаркте [1-3].

Полученные нами экспериментальные данные свидетельствуют о защитном действии дистантного ишемического и фармакологического прекондиционирования никорандилом, выражающемся в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции. Пути реализации данных эффектов предполагаются различные. У никорандила он обусловлен в основном влиянием на АТФ-зависимые калиевые каналы. В связи с чем блокада КАТФ-каналов глибенкламидом обнаружила нивелирование положительных эндотелиопротективных эффектов никорандила, выразившееся в повышении КЭД; а механизмы эндотелиопротективных свойств дистантного ишемического прекондиционирования обусловлены дополнительным влиянием на метаболизм оксида азота.

Выводы

1. Дистантное ишемическое прекондиционирование и фармакологическое прекондиционирование никорандилом могут рассматриваться как способы предупреждения повреждения эндотелия сосудов, что имеет важное значение для определения возможного спектра применения различных видов прекондиционирования в клинической практике.

2. Индуцибельная NO-синтаза играет важную роль в формировании эндотелиопротекторного эффекта дистантного ишемического прекондиционирования.

Механизм эндотелиопротекторного эффекта никорандила зависит главным образом от чувствительных АТФ-зависимых калиевых каналов.

Рецензенты:

Маль Г.С., д.м.н., профессор, заведующая кафедрой фармакологии КГМУ, г. Курск.

Будко Е.В., д.м.н., профессор КГМУ, г. Курск.


Библиографическая ссылка

Даниленко Л.М. ПУТИ РЕАЛИЗАЦИИ ДИСТАНТНОГО ИШЕМИЧЕСКОГО ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ И ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ НИКОРАНДИЛОМ ПРИ L-NAME ИНДУЦИРОВАННОМ ДЕФИЦИТЕ ОКСИДА АЗОТА // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 5.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=10713 (дата обращения: 10.12.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074