Введение
В норме биогенез и функционирование хлоропластов находятся под генетическим контролем ядра и клеточных органелл, их гармоничным взаимодействием. Однако механизмы такого взаимодействия до сих пор изучены не достаточно глубоко (Даниленко, Давыденко, 2003). Многолетние исследования, проводимые в нашей лаборатории, всегда были направлены на решение большой и сложной проблемы пластидно-ядерных взаимоотношений (Белецкий, 1989; Зиноватная и др., 1995; Усатов и др., 2010).
Одним из перспективных подходов в этой области является создание и исследование генетических моделей, совмещающих в себе мутантные пластиды и ядерные хлорофильные мутации. Коллекция хлорофильных мутантов различной генетической природы, имеющаяся в нашем распоряжении (Усатов и др., 2004а), является удобным исходным материалом для создания таких совмещённых форм. Широкий спектр хлорофильных мутаций, представленных в коллекции, позволяет наиболее полно охватить функциональные взаимосвязи между клеточными компартментами растительной клетки (Усатов и др., 2004б; Рассадина и др., 2005). Уникальность коллекции заключается в том, что все хлорофильные мутанты получены с помощью N-нитрозо-N-метилмочевины (НММ) на генетической основе одной инбредной линии (Усатов и др., 1995; Усатов и др., 2005).
Целью работы является совмещение и анализ в одном растительном организме мутантного пластома с хлорофильными мутациями ядерной природы подсолнечника.
Материал и методы
Объектом исследований служили растения исходной линии 3629 подсолнечника Helianthus annuus L., также хлорофилльные ядерные монорецессивные (n:chlorina-3, n:chlorina-5) и пластомные мутанты (en:chlorina-6, en:chlorina-7), полученные на её генетической основе. Совмещение мутантных пластид с мутантными ядерными генами проводили с предварительной кастрацией цветков и искусственным опылением с последующей изоляцией соцветий по следующей схеме:
Родители - pHH x Phh
F1 - pHh
F2 - 1pHH : 2pHh : 1phh, где
Р - нормальный пластом, р - мутантный пластом, H и h - ядерные хлорофилльные гены дикого и мутантного типов, соответственно.
Поскольку передача пластома у подсолнечника происходит строго по материнской линии, внеядерные хлорофилльные мутанты en:chlorina-6 и en:chlorina-7 использовали в гибридизации в качестве материнских растений. Изучали F1-F2 поколения. Для статистической оценки результатов расщепления применяли метод χ2. У линий и гибридов F1, F2 в фазу бутонизации в листьях определяли содержание хлорофиллов (Гавриленко и др., 1975), а в фазу полного созревания высоту растений и диаметр корзинок. В промерах использовали не менее 20 растений каждой формы. Статистическую значимость результатов оценивали по критерию Стьюдента (Бейли, 1973).
Результаты и их обсуждение
В F1 были получены 4 гибридные формы. Две из них - с мутантным пластомом en:chlorina-6 и рецессивными хлорофильными мутациями n:chlorina-3 и n:chlorina-5 в гетерозиготном состоянии и две - с пластомом en:chlorina-7 с соответствующими ядерными генами. Все растения 1-го гибридного поколения этих скрещиваний имели мутантную жёлто-зелёную окраску листьев, не отличаясь по содержанию хлорофиллов и показателям габитуса от материнских форм en:chlorina.
Результаты изучения F2 представлены в таблице 1. Во 2-м гибридном поколении, как и в 1-м, все растения имеют мутантный пластом. В дополнении к этому, у 1/4 растений мутантный ядерно-рецессивный хлорофильный ген находится в гомозиготном состоянии. Вследствие этого у гибридов в F2 наблюдается расщепление на два типа растений: chlorina, то есть растения, фенотипически повторяющие материнскую форму, и растения промежуточного типа между жёлто-зелёной chlorina и xantha (летальный тип хлорофильной мутации с жёлтым цветом листьев). В нашем случае промежуточные формы были представлены жизнеспособными растениями с резко уменьшенным габитусом и количеством зелёных пигментов по сравнению с мутантными родителями (табл. 2). В двух гибридных скрещиваниях en:chlorina-7 x n:chlorina-3 и en:chlorina-7 x n:chlorina-5 наблюдается классическое менделевское расщепление, т.е. 1/4 таких растений с усилением дефекта окраски, что соответствует количеству растений, несущих хлорофилл-мутантный ядерный ген в гомозиготном состоянии. У гибридов en:chlorina-6 x n:chlorina-3 и en:chlorina-6 x n:chlorina-5 числовые отношения при расщеплении значительно отклоняются от теоретически ожидаемого 3:1 (табл. 1).
Таблица 1
Расщепление в потомстве гибридов F1
|
Вид скрещивания |
Фенотип растений F2 |
Х2, Р |
|
|
xantha |
chlorina |
|
|
|
en:chlorina-6 x n:chlorina-3 |
33 |
149 |
4,579; Р>0,05 |
|
en:chlorina-6 x n:chlorina-5 |
37 |
163 |
4,507; P>0,05 |
|
en:chlorina-7 x n:chlorina-3 |
58 |
181 |
0,068; Р<0,05 |
|
en:chlorina-7 x n:chlorina-5 |
46 |
149 |
0,207; Р<0,05 |
Возможно, совмещение мутантного хлорофильного ядерного гена и мутантных пластид, усугубляя хлорофильный дефект и понижая жизнеспособность гибридных растений, обуславливает нехватку гомозигот по ядерному хлорофильному гену.
В таблице 2 приведены результаты полевых измерений габитуса растений и содержания хлорофиллов контрольной зеленой линии 3629, исходных мутантов chlorina и гибридов F2 типа xantha. Видно, что родительские мутанты chlorina отличаются от исходных зеленых растений линии 3629 по высоте (64,6 % - 82,8 %) и диаметру корзинки (60,4 % - 76,2 %). Причем самые низкие показатели габитуса представлены у мутанта n:chlorina-3, а самые высокие - у en:chlorina-7.
Таблица 2
Показатели габитуса растений и содержания хлорофиллов у зеленой линии 3629, мутантов chlorina и гибридов F2 типа xantha
|
Линии и гибриды |
Высота растений, см |
Диаметр корзинки, см |
Содержание хлорофил. а+в, мг/г абс. сух. веса |
|
3629 |
108,9 ± 2,7 |
10,1 ± 0,7 |
7,52 ± 0,23 |
|
en:chlorina-6 |
84,4 ± 3,3 |
7,2 ± 0,4 |
6,21 ± 0,21 |
|
en:chlorina-7 |
90,2 ± 3,0 |
7,7 ± 0,5 |
5,78 ± 0,19 |
|
n:chlorina-3 |
70,3 ± 2,2 |
6,1 ± 0,4 |
5,11 ± 0,18 |
|
n:chlorina-5 |
79,8 ± 2,9 |
7,0 ± 0,4 |
4,60 ± 0,15 |
|
en:chlorina-6 x n:chlorina-3 |
51,8 ± 2,7 |
5,2 ± 0,3 |
3,09 ± 0,22 |
|
en:chlorina-6 x n:chlorina-5 |
57,2 ± 2,1 |
5,7 ± 0,4 |
2,67 ± 0,15 |
|
en:chlorina-7 x n:chlorina-3 |
63,1 ± 2,4 |
5,6 ± 0,3 |
2,78 ± 0,17 |
|
en:chlorina-7 x n:chlorina-5 |
68,3 ± 3,3 |
6,0 ± 0,4 |
2,57 ± 0,14 |
Хлорофильные ядерные гены, находясь в гомозиготном состоянии, в комбинации с мутантными пластогенами, существенно влияют на габитус гибридов F2, снижая в различной степени показатели роста и диаметра корзинки, как по сравнению с материнскими внеядерными мутантами (en:chlorina-6 и en:chlorina-7), так и отцовскими - ядерными (n:chlorina-3 и n:chlorina-5), соответственно. При этом самые низкорослые формы получены в результате скрещивания en:chlorina-6 x n:chlorina-3 (47,6 % высота растений и 51,5 % диаметр корзинки от соответствующих показателей растений 3629), а самые мощные - в результате скрещивания en:chlorina-7 x n:chlorina-5 (62,7 % высота растений и 59,4 % диаметр корзинки от соответствующих показателей растений 3629).
Из таблицы 2 следует, что содержание хлорофиллов в пластомных мутантах en-chlorina-6 и en-chlorina-7 составляет только 82,6 % и 76,9 % от контроля, соответственно. В листьях ядерных хлорофильных мутантов n:chlorina-3 и n:chlorina-5 содержание зелёных пигментов ещё меньше - 68,0 % и 61,2 % от их содержания в норме. У гибридов F2 типа xantha содержание пигментов примерно вдвое ниже, чем у соответствующей родительской формы с наименьшим содержанием хлорофиллов.
Таким образом, во всех изученных комбинациях скрещиваний, при совмещении мутантных ядерных и пластидных генов, у гибридов с фенотипом xantha происходит резкое снижение показателей габитуса и содержания хлорофиллов, относительно не только зелёных растений 3629, но и жёлто-зелёных мутантов chlorina. Следовательно, объединение мутантных наследственных систем ядра и пластид вызывает значительное усиление хлорофильных дефектов. Полученные формы являются хорошей моделью для исследования тонких механизмов взаимодействия ядерного генома и пластома в биогенезе и функционирования хлоропластов.
Исследование выполнено в рамках темы Министерства образования и науки РФ (№ 4.5642.2011) и при финансовой поддержке ФЦП Министерства образования и науки РФ (госконтракт № 16.740.11.0485).
Рецензенты:
Чистяков В. А., доктор биологических наук, заведующий лабораторией экспериментального мутагенеза НИИ биологии ЮФУ, 344090 г. Ростов-на-Дону.
Михайлов Н. В., доктор сельскохозяйственных наук, заведующий лабораторией молекулярной диагностики и биотехнологии НИИ биоинформатики, биотехнологии и живых систем ДонГАУ, 346493, Ростовская область, Октябрьский район, поселок Персиановский.