Введение
Апоптоз – один из видов программируемой клеточной гибели - играет двоякую роль в образовании, росте опухолей и их ответе на противоопухолевое лечение. С одной стороны, известно, что эффект противоопухолевых терапевтических воздействий реализуется путем запуска ПКГ, и в частности апоптоза [6].Сдругойстороны,существуютданные, свидетельствующиеотом, чторазвитиеиростопухолейтакжесопровождаютсяувеличениемуровняапоптоза[2; 3;5;8-10]. Вработе[4] показано, что апоптоз, индуцированный лучевой терапией, может стимулировать восстановление популяции опухолевых клеток как invitro, так и invivo за счет усиления синтеза простагландина Е, который, в свою очередь, стимулирует рост опухолевых клеток.
Все это указывает на важность изучения роли апоптоза в биологии опухолевого роста иреализации эффектов противоопухолевых воздействий.
Ключевым ферментом апоптоза является каспаза-3.В ИНБИ им.А.Н.Баха РАН разрабатываются генетически кодируемые сенсоры для прижизненной визуализации активности каспазы-3. Ранее был разработансенсор каспазной активности, представляющий собой FRET-пару цветных белков TagRFPиKFP, связанных между собой линкером. В результате разрезания линкера каспазой-3 нарушаются условия FRET,и флуоресценция донора увеличивается [1]. Клетки опухолей человека, трансфицированные данной генно-инженерной конструкцией,демонстрировали увеличение интенсивности и времени жизни флуоресценции трансфицированных клеток [7].Следующим шагом в работе являлось получение моделей на основе трансфицированных клеток для исследований invivo.
Цель исследования
Целью настоящей работы является характеристика роста и флуоресцентных свойств опухоли А-549, полученной путем имплантации иммунодефицитныммышам опухолевых клеток, трансфецированных конструкцией TR23K.
Материалы и методы
В работе использованы мыши nu/nu, самки, массой 19-21 г, разведения питомника «Пущино».Все исследования на животных проводились в соответствии с национальными требованиями к гуманному обращению с экспериментальными животными.
Животные содержались в специальных модулях при температуре 26°С в клетках, оснащенных HEPA-фильтрами, поддерживающими стерильность внутри клеток.
На протяжении всего эксперимента мыши получали сертифицированный полнорационный корм «Чара» (ЗАО «Ассортимент Агро», Россия) и воду без ограничений.
Опухоли получали путем инокуляции под кожу спины мышей клеток линии А-549 (аденокарцинома легкого человека), трансфицированных конструкцией TRK23K.
Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста путем пассированиякультуры через 2-3 дня в соотношении 1:3 или 1:4.
Для получения прививочного материала клетки, выращенные в вентилируемых культуральных флаконах (CorningCostar, США), обрабатывали смесью трипсин-ЭДТА, отмывали в растворе DPBS(«ПанЭко», Россия), центрифугировали 5 минут при 1000 об/мин, ресуспендировали в растворе DPBS до состояния клеточной суспензии, состоящей из одиночных клеток. Количество жизнеспособных клеток в суспензии определяли по окрашиванию трипановым синим с последующим подсчетом в камере Горяева. Создавали «концентрацию» клеток 20 млн/мл и прививали мышам в объеме 0,05 мл. Прививочная доза составляла таким образом – 1 млн клеток.
День прививки считали нулевым днем роста опухоли.
Опухолиизмеряли2-3 раза в неделюштангенциркулем и затем рассчитывали размер по формуле: Vопухоли= π/6*a*b*c, где a,b,c – длина, ширина и высота опухоли, соответственно. Вклад кожи при этом не учитывался.
Срок наблюдения за животными составил 45дней.
Флуоресцентные исследования проводили методом планарной томографии.
Измерения флуоресценции проводили invivo2-3 раза в неделю. Для этого мышей обездвиживали на растяжках с помощью «дышащего» пластыря Omnifilm или наркотизировали с смесью золетил : рометар в соотношении 1 : 1 в объеме 0,04 мл/мышь. Наркозу животных подвергали не чаще, чем 2 раза в неделю.
Флуоресцентные изображения получали на автоматизированной системе iBox (UVP, США) для анализа изображений лабораторных животныхinvivo. Базовым элементом установки является тёмный бокс с моторизованным лифтом и фильтрами для вырезания диапазона длин волн, требуемого для возбуждения и регистрации флуоресценции. Установка оснащена автоматизированным источником Biolite для эпилюминесценции и охлаждаемойCCD-камерой.
Флуоресценцию возбуждали в диапазонедлин волн 502-547 нм, регистрацию осуществляли в диапазоне 570-640 нм.Анализ изображений проводили с помощью программы ImageJ.При математической обработке флуоресцентных изображений выделяли области опухоли и кожи, определяли среднюю интенсивность флуоресценции и нормировали среднюю интенсивность флуоресценции опухоли на среднюю интенсивность участка кожи.
Результаты
После прививки клеток А-549-TR23Kопухолевые узлы развивались у всех животных(n=10). Латентный период варьировал от 6 до 14дней. У 90%мышей он составлял 6-8 дней.
В течение месяца наблюдался устойчивый рост опухолей (рис.1). Случаев спонтанной регрессии не отмечено.
Рис.1. Изменение размеров опухоли А549-TR-23-K в течение срока наблюдения.
Результаты изучения флуоресцентных свойств опухоли А549-TR-23-K представлены на рис.2-4.
6
10 
15 
23 
Дни роста опухоли
Рис.2. Флуоресцентные изображения мыши с опухолью А-549-TR23Kвразличные сроки после имплантации опухолевых клеток.
Рис.3. Изображения мыши с опухолью А-549-TR23Kна 38-й день роста опухоли, полученные в белом свете (а) и при возбуждении флуоресценции (б).
Рис.4. Изменение интенсивности флуоресценции опухоли А-549-TR23Kв процессе ее роста. Представлены данныепо средней интенсивности флуоресценцииопухоли
Как видно из рисунков, распределение флуоресценции по опухоли неравномерно (например, рис.2 в, д). У некоторых мышей в зоне прирастания опухоли к коже образовывался некроз с формированием струпа, который был аранжирован участками более яркой флуоресценции, чем остальная опухоль (рис.3). При этом интенсивность флуоресценции как отдельных участков, так и в среднем по опухоли возрастала по мере ее роста (рис.4).
Увеличение интенсивности флуоресценции в опухоли по мере ее роста может быть вызвано различными причинами, напримерза счет увеличения количества флуоресцирующих опухолевых клеток.Кроме того, как описано в работе [8], при прогрессировании злокачественных новообразований в опухолевых клетках может возрастать активность каспазы-3. Если увеличение активности этого фермента происходит и в опухоли А-549-TR23K, то это может приводить к расщеплению субстрата каспазы-3 TR23K и, следовательно, к увеличению интенсивности люминесценции опухолевого очага в целом. В пользу этого предположения свидетельствуют данные о яркой флуоресценции в зоне распада опухоли (рис.3). По мере роста в клетках может увеличиваться синтез флуорофора или происходить «разбалансировка» экспрессии пары цветных белков, и, например,можетэкспрессироватьсясвободныйTagRFP, который, как указано выше, люминесцирует ярче, находясь в свободном состоянии, чем при связывании с KFP. Можно выдвинуть еще ряд предположений, но все они, как и высказанные выше, нуждаются в экспериментальной проверке.
Таким образом, природа изменения флуоресценции требует детального изучения. Информация об условиях эффективного действия сенсора, в частности потенциального влияния на него спонтанного апоптозатрансдуцированных опухолевых клеток, необходима при последующем тестировании новых противоопухолевых средств, изучении апоптотического статуса экспериментальных опухолей и его влияния на эффективность противоопухолевых воздействий.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки по государственному контракту № 14.512.11.0023.
Рецензенты:
Королева О.В., д.б.н., зав. лабораторией молекулярных основ биотрансформаций Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, г.Москва.
Шишкин С.С., д.б.н., профессор, зав. лабораторией биомедицинских исследований Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, г.Москва.