Введение
Использование растений в качестве лекарств пришло в наш век из глубокой древности и до сих пор играет значительную роль в арсенале лекарственных средств современной медицины. Это обусловлено некоторыми преимуществами препаратов фитотерапии по сравнению с синтетическими лекарствами.
Одним из основных преимуществ растительных лекарств является низкая частота побочных явлений. Интерес к фитотерапии вызван также изменением в современном мире возрастной структуры населения, а именно – увеличением лиц пожилого возраста, которые, как правило, страдают хроническими заболеваниями, требующими длительного применения лекарственных средств, и риск развития побочных явлений при этом должен быть минимальным. Особую роль фитотерапия занимает в педиатрической практике, так как лекарственные растения действуют мягче и реже дают нежелательные осложнения.
Низкую частоту побочных явлений можно объяснить тем, что растительное лекарство – это комплекс, включающий в себя биологически активные вещества (БАВ): протеины, микроэлементы, витамины, эфирные масла и многие другие, который, по существующему мнению, сформировавшись в живой клетке, имеет большее сходство с человеческим организмом, чем изолированное, химически чистое действующее вещество, в связи с чем, он легче ассимилируется и дает меньше побочных эффектов [5].
Очень велики возможности комплексного применения лекарственных средств растительного происхождения, так как лекарственные растения в своем большинстве совместимы между собой и другими лекарственными веществами, и при сочетании лекарственных растений часто проявляется синергизм их действия.
Необходимо отметить, что лекарственное растительное сырье является наиболее дешевым и доступным источником получения лекарственных средств [5].
В настоящее время в качестве лекарственного сырья широко используются высшие растения, среди которых особое внимание привлекают копеечник чайный и астрагал шерстистоцветковый. Так известно, что настой из астрагала шерстистоцветкового используется для лечения начальных форм гипертонической болезни, недостаточности кровообращения I и II степеней, а также при острых гломерулонефритах на ранней стадии болезни. Из этой травы получен экстракт в таблетках «Мукалтин», основным действующим веществом которого являются тритерпеновые сапонины, производные дазиантогенина и флавоноидные гликозиды [2]. Другое растение, копеечник чайный или красный корень, содержит дубильные вещества, ксантон хедизарид, тритерпеновые сапонины, кумарины, флавоноиды, свободные аминокислоты и обладает противовоспалительным, сосудорасширяющим, антиоксидантным и общетонизирующим действием [1].
Целью данной работы было изучение в культуре клеток MDCK противогриппозных свойств водных и этанольных экстрактов, выделенных из высших растений копеечника чайного и астрагала шерстистоцветкового.
Материалы и методы
Экспериментальные образцы экстрактов. В работе использовали водные и этанольные экстракты из высших (Radices Hedysari theini, копеечник чайный и Herba Astragali dasyanti, астрагал шерстистоцветковый) растений, полученные под руководством профессора Трошковой Г. П. и сотрудников, как описано ранее [3].
Культура клеток. Для определения токсичности и противовирусной активности экстрактов использовали перевиваемую линию клеток почки собаки кокер-спаниеля MDCK, полученную из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Клеточную суспензию разводили предварительно подогретой до температуры 37 ºC средой RPMI-1640 (ООО «БиолоТ», г. Санкт-Петербург), содержащей 10 % сыворотки крови плодов коровы (ООО «БиолоТ», г. Санкт-Петербург), до концентрации 1,0– 1,5×105 клеток/мл и вносили по 100 мкл/лунку 96-луночного планшета. Затем планшеты с клетками помещали в термостат при температуре 37 ºC, 5% СО2 и 100 % влажности на 2–3 сутки до образования клеточного монослоя.
Вирусы. В работе использовали штамм вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и адаптированный к лабораторным мышам штамм вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2), полученные из отдела «Коллекция микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» и наработанные на 10-суточных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). Инфекционный титр штаммов вируса гриппа выражали в ТЦД50/мл (пятидесятипроцентная тканевая цитопатическая доза) [4].
Определение токсичности экстрактов in vitro. Для определения токсических концентраций образцы экстрактов из высших растений разводили в несколько раз (в 2, 5, 10, 100, 1000, 10000 раз) средой RPMI-1640, содержащей 5 % сыворотки крови плодов коровы, вносили в монослой клеток MDCK по 100 мкл/лунку планшета и помещали в термостат при температуре 37 ºC, 5 % СО2 и 100 % влажности на двое суток. Через 2-е суток оценивали наличие или отсутствие токсического действия растительных экстрактов на монослой клеток MDCK с помощью инвертированного микроскопа [4].
Определение противовирусной активности экстрактов in vitro. В исследованиях по определению противовирусной активности экстрактов использовали их максимально переносимые концентрации (МПК). Готовили разведения вируссодержащей жидкости от 1 до 8 с десятикратным шагом на среде RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Для определения противовирусной активности растительных экстрактов в профилактической схеме в монослой культуры клеток MDCK вносили образцы в объеме 50 мкл/лунку в максимально переносимой концентрации, после инкубирования клеток при температуре 37 °С в атмосфере 5 % CO2 в течение 1 ч вносили разведения вируссодержащей жидкости в объеме 50 мкл/лунку и вновь инкубировали клетки в течение 2–3 суток при температуре 37 °С в атмосфере 5 % CO2. По окончании инкубирования клеток регистрировали цитопатическое действие вируса (ЦПД) в монослое клеток с помощью инвертированного микроскопа и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1 % эритроцитами петуха [4].
Результаты и обсуждение
Цитотоксическое действие экстрактов на клетки MDCK. Установлено, что 50 %-я цитотоксическая доза (ТС50) экстрактов, полученных из высших растений, составляла от 0,05 до 1,0 мг/мл для разных образцов (таблица).
Таблица
Противовирусная активность водных и этанольных экстрактов высших растений в клетках MDCK, зараженных вирусом гриппа А (профилактическая схема)
|
Образец |
Концентра- ция сухого вещества в экстракте, мг/мл |
Токсич- ность для клеток MDCK (ТС50), мг/мл |
Инфекционность вируса (титр) в клетках MDCK в lg ТЦД50/мл (М±m, n=3) |
Индекс нейтрализации (Титр контроль - Титр опыт), lg |
||||
|
Наиме-нование |
№ |
|||||||
|
А/Aichi/2/68* |
А/chiken/ Kurgan/ 05/2005® |
А/Aichi/2/68 |
А/chiken/Kurgan/05/2005 |
|||||
|
Herba Astragali dasyanti |
21 W♠ |
5,0 |
0,05 |
4,3±0,5 |
6,3±1,1# |
0 |
1,5 |
|
|
Radices Hedysari theini |
22 E♥ |
5,0 |
1,0 |
1,5±0,7# |
7,8±1,0 |
2,8 |
0 |
|
Примечание: М – среднее арифметическое, m – ошибка среднего, * титр вируса А/ Aichi/2/68 в контроле составлял 4,3±0,5 lg ТЦД50/мл; ® титр вируса A/chiken/Kurgan/05/2005 в контроле составлял 7,8±1,0 lg ТЦД50/мл; # отличие от титров в контроле по t-критерию Стьюдента при р≤0,05; n-число экспериментов; ♠ – водный экстракт♥ – этанольный экстракт.
Изучение протективных свойств растительных экстрактов в отношении вируса гриппа А in vitro. Для оценки противовирусной активности растительных экстрактов в опытах in vitro использовали их нетоксические концентрации. Данные противовирусной активности экстрактов на клетках MDCK в отношении вируса гриппа А представлены в таблице. Как видно из таблицы, водный экстракт высшего растения астрагала шерстистоцветкового (Herba Astragali dasyanti) ингибирует размножение вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) (индекс нейтрализации (ИН) составляет 1,5 lg), но не подавляет размножение вируса гриппа человека А/Aichi/2/68 (H3N2). При этом этанольный экстракт, полученный из этого же растения, в экспериментах in vitro не подавляет репродукцию ни вируса гриппа птиц, ни вируса гриппа человека (данные не приведены).
Исследование водного и этанольного экстрактов другого представителя высших растений – копеечника чайного (Radices Hedysari theini) показало, что только его этанольный вариант проявляет противовирусную активность и только в отношении вируса гриппа человека субтипа A(H3N2) (ИН штамма А/Aichi/2/68 составляет 2,8 lg) (таблица). Водный же экстракт копеечника чайного сколь-нибудь заметной противогриппозной активности в отношении вирусов гриппа субтипов A/H5N1 и A/H3N2 не обнаруживают (данные не приведены). На основании полученных данных можно предположить, что для подавления репродукции вирусов гриппа А/Aichi/2/68 (H3N2) и A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) в культуре клеток MDCK необходимы разные биологически активные вещества (БАВ) или их композиции.
Заключение
Полученные результаты по противовирусной активности экстрактов высших растений копеечника чайного и астрагала шерстистоцветкового открывают возможность разработки новых противогриппозных препаратов на основе этого растительного сырья. При этом важно, что экстракты, обнаружившие противовирусную активность в отношении штаммов вируса гриппа человека и птиц, обладают низкой токсичностью для эукариотических клеток.
Детальное изучение химического состава, фармакологических свойств, а также доклинических и клинических испытаний БАВ (и/или композиций БАВ) из этих растений позволят разработать и внедрить в практику здравоохранения новые эффективные растительные препараты на их основе против вируса гриппа.
Рецензенты:
Шишкина Л. Н., д.б.н., заведующая отделом профилактики и лечения особо опасных инфекций, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», п. Кольцово, Новосибирская область.
Белявская Валентина Александровна, д.б.н., профессор, заведующая сектором отдела научно-методической подготовки персонала по работе с возбудителями особо опасных инфекций, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», п. Кольцово, Новосибирская область.