Введение
Важнейшей медико-социальной проблемой современной педиатрии является цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ), что обусловлено тяжестью течения заболевания, склонностью к генерализации, высокой частотой поражения ЦНС, трудностью своевременной диагностики и терапии [7, 8]. При этом актуальность проблемы обусловлена и тем, что у 50 % детей, перенесших тяжелые формы ЦМВИ, развиваются серьезные нарушения здоровья, нередко приводящие к инвалидизации и снижению качества жизни в целом [1, 2, 9]. Учитывая, что реализация инфекционного процесса определяется патогенностью возбудителей инфекции и эффективностью защитных сил организма, важная роль отводится состоянию иммунной системы [5].
Известно, что у новорожденных детей имеет место незрелость механизмов адаптивного компонента иммунной системы - отсутствует иммунологическая память и снижена способность к формированию специфических антител к патогенам, поэтому защита от инфекции зависит главным образом от состояния врожденного иммунитета и их гуморальных компонентов [3]. При этом реализация специфичности врожденной иммунной системы ложится на семейство TLR-рецепторов, связывание которых микробными продуктами приводит к продукции цитокинов, что в дальнейшем определяет характер, направление и интенсивность адаптивного иммунного ответа [4]. Несмотря на многочисленные исследования, посвященные данной проблеме, многие вопросы до настоящего времени остаются нерешенными.
Целью исследования явилось выявление новых патогенетических механизмов развития генерализованной цитомегаловирусной инфекции у новорожденных детей.
Материал и методы исследования
Изучены клинико-лабораторные данные 47 новорожденных с генерализованной ЦМВИ в раннем неонатальном периоде (основная группа). Согласно классификации Орехова К. В. (2002) дети с генерализованной ЦМВИ были разделены на две подгруппы: I подгруппа (29 детей) - типичная генерализованная форма с полной клинической симптоматикой, II подгруппа (18 детей) - типичная генерализованная форма с неполной клинической симптоматикой. Контрольную группу составили 26 клинически здоровых новорожденных, родившихся у женщин с физиологическим течением беременности и родов.
Диагноз внутриутробной ЦМВИ ставился на основании клинической картины заболевания, выявления ДНК ЦМВ в крови и в моче, нарастания титров специфических IgG к ЦМВ в динамике, обнаружения IgM в сыворотке крови у ребенка.
Определение экспрессии TLR-2(СD14+СD282+) и TLR-6(СD14+СD286) на моноцитах проводили методом лазерной проточной цитофлюорометрии (Beckman Coulter, США). Полиморфизм аллельных вариантов генов TLR изучали методом ПЦР с последующим рестрикционным анализом тест-системами для молекулярно-генетического анализа, разработанными ГосНИИгенетика (Москва). Содержание цитокинов в сыворотке крови определялось методом ИФА согласно рекомендациям производителя: IFN-γ, IFN-α, IL-8 - с использованием тест-систем «Biosource» (США), MCP-1 (моноцитарный хемоаттрактантный протеин 1) - с применением тест-систем «Bender Medsistems» (Австрия).
При определении статистической обоснованности различия исследуемых групп применялся критерий Манна-Уитни для независимых групп и критерий Вилкоксона для зависимых групп при максимально допустимом уровне ошибки первого рода р=0,05. Для анализа различия частот в двух независимых группах применялся двусторонний критерий Фишера-Ирвина с принятым уровнем ошибки первого рода р=0,05. Для оценки тесноты связи отдельных показателей использовался коэффициент корреляции по Спирмену.
Результаты и обсуждение
Анализ клинических данных позволил установить, что в раннем неонатальном периоде у детей I подгруппы (с полной клинической симптоматикой ЦМВИ) достоверно чаще встречались, чем у пациентов II подгруппы (с неполной клинической симптоматикой заболевания): гепатомегалия, гепатит, геморрагический синдром, тромбоцитопения, пневмония, постгипоксическая кардиопатия, судорожный синдром, синдром угнетения рефлексов, патологическая убыль в массе тела. Менингоэнцефалит, отечный синдром, миокардит имели место только у пациентов I подгруппы.
Развитие генерализованной ЦМВИ у наблюдаемых новорожденных детей сопровождалось значительными изменениями в иммунном статусе, особенно у детей с полной клинической симптоматикой. Так, в I подгруппе выявлено достоверное снижение экспрессии TLR-2 (CD14+CD282+) на моноцитах периферической крови по сравнению с контрольной группой (45,4±8,9 % и 76,2±5,6 % соответственно, р<0,05) и по сравнению со II подгруппой (45,4±8,9 % и 65,1±6,1 % соответственно, р<0,05). Установлена обратная корреляционная зависимость с уровнем вирусной нагрузки (r=0,81, p<0,05). Аналогичные изменения были характерны и для TLR-6 (CD14+CD286+): достоверно более низкие значения экспрессии TLR-6 определялись в I подгруппе (44,6±5,9 %) относительно контроля (61,1±1,4 %, р<0,05) и относительно II подгруппы (57,8±2,2 %, р<0,05). Обнаруженное снижение экспрессии TLR-2 и TLR-6 объясняет высокую чувствительность к ЦМВИ и может обусловливать их участие в развитии клинической картины заболевания.
Проведенные исследования частоты полиморфизмов генов TLR-2 и TLR-6 у детей с генерализованной ЦМВИ в зависимости от выраженности клинических проявлений заболевания установили, что у новорожденных I подгруппы с полной клинической симптоматикой в сравнении со II подгруппой детей с неполной клинической симптоматикой, частота генотипа Ser/Pro была достоверно выше (68,4 % и 12,5 % соответственно, р<0,05), а генотипа Pro/Pro достоверно ниже (26,3 % и 81,3 % соответственно, р<0,05). Таким образом, аллельные варианты гена TLR-6 в точках полиморфизма Ser249Pro могут являться генетическими маркерами развития генерализованной ЦМВИ с полной клинической симптоматикой, а генотип Pro/Pro является протективным в отношении тяжести течения генерализованной ЦМВИ.
Результаты исследования содержания про- и противовоспалительных цитокинов и хемокинов у новорожденных детей с генерализованной ЦМВИ с учетом клинических проявлений заболевания представлены в таблице 1.
Таблица 1
Содержание про- и противовоспалительных цитокинов и хемокинов у новорожденных с генерализованной ЦМВИ (пг/мл)
|
Показатели |
Дети с генерализованной ЦМВИ |
Контрольная группа(n=26) |
|
|
I подгруппа |
II подгруппа |
||
|
IFN -α |
8,3±0,9* |
10,7±1,1* |
15,9±2,1 |
|
IFN -γ |
42,1±9,7*▲ |
86,5±21,9 |
100,8±27,4 |
|
MCP-1 |
1083,2±258,4* |
783,5±223,1 |
600,5±53,9 |
|
IL -8 |
71,3±5,8*▲ |
40,7±11,3 |
26,3±7,7 |
|
IL -4 |
264,9±24,2*▲ |
138,9±41,1 |
74,1±24,8 |
* - достоверность различий по сравнению с контрольной группой (p<0,05);
▲- достоверность различий между I и II подгруппами (p<0,05).
Установлено, что у всех наблюдаемых детей с генерализованной ЦМВИ (как в I, так и во II подгруппах) имело место достоверное снижение уровня интерферона -α (IFN - α) в сыворотке крови по сравнению с контрольной группой (р<0,05).
Известно, что интерферон -γ (IFN-γ) играет важную роль в развитии иммунного ответа Тh1 типа. Анализ полученных данных показал, что в I подгруппе его содержание в сыворотке крови был в 2,4 раза ниже по сравнению с контрольной группой (р<0,05) и в 2,1 раза ниже, чем во II подгруппе. Во II подгруппе концентрация IFN-γ достоверно не отличалась от показателей контрольной группы.
Моноцитарный хемоаттрактантный протеин 1 (MCP-1) - представитель семейства СС-хемокинов выступает в роли мощного аттрактанта для моноцитов/макрофагов и активированных Т-лимфоцитов. В нашем исследовании только у детей I подгруппы (с полной клинической симптоматикой ЦМВИ) содержание МСР-1 достоверно превышало показатели контрольной группы (1083,2±258,4пг/мл и 600,5±53,9пг/мл соответственно, р<0,05). Полученные данные свидетельствуют о том, что цитомегаловирус может использовать хемокиновые рецепторы для контроля репликации вирусов [6] и приводить к сдвигу дифференцировки Т-хелперов в направлении Th2, не обеспечивающих формирование эффективного противовирусного иммунного ответа.
Уровень интерлейкина-8 (IL-8) - основного хемокина, участвующего в процессах миграции лейкоцитов, у детей I подгруппы был в 2,7 раз выше по сравнению с контрольной группой (р<0,05) и в 1,8 раз выше, чем во II подгруппе (р<0,05). Выявлена прямая корреляционная зависимость содержания IL-8 и уровня вирусной нагрузки (r=0,81, p<0,05), что свидетельствует о влиянии IL-8 на репликацию цитомегаловируса.
Содержание интерлейкина - 4 (IL-4) - противовоспалительного цитокина, относящегося к субпопуляции Тh-2, у детей I подгруппы было достоверно выше, как по сравнению с контрольной группой, так и II подгруппой (р<0,05), что отражает доминирование противовоспалительных цитокинов и ведет к снижению противовирусной иммунной защиты.
Проведенные исследования у детей с генерализованной ЦМВИ выявили нарушения взаимодействия врожденного и адаптивного иммунного ответа, зависящие от выраженности клинической симптоматики заболевания. Полученные данные являются обоснованием для дифференцированного подхода к оптимизации терапии генерализованной ЦМВИ у новорожденных детей.
Выводы
1. У детей при генерализованной ЦМВИ с полной клинической симптоматикой имеет место снижение экспрессии TLR-2 и TLR-6 на моноцитах, приводящее к редукции синтеза IFN-α и IFN-γ, выявлены: полиморфизм Ser249Pro гена TLR-6, повышение уровня MCP-1, IL-8 и IL-4. При ЦМВИ с неполной клинической симптоматикой отмечается только снижение концентрации IFN-α.
2. Дисбаланс факторов врожденного и адаптивного иммунного ответа приводит к изменению их взаимодействия, обусловливающего усиление вирусной репликации, сдвиг дифференцировки Т-хелперов в направлении Th2, не обеспечивающих формирование эффективного противовирусного иммунного ответа, что является одним из механизмов развития генерализованной ЦМВИ.
Рецензенты:
Попова Виктория Александровна, доктор медицинских наук, главный научный сотрудник педиатрического отдела ФГБУ «РНИИАП» Министерства здравоохранения России, г. Ростов-на-Дону.
Лебеденко Александр Анатольевич, доктор медицинских наук, заведующий кафедрой детских болезней № 2 ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет», г. Ростов-на-Дону.