Введение
На протяжении многих исследований было показано, что низкоинтенсивное миллиметровое излучение влияет на биохимические процессы. При этом известно, что СВЧ-излучение миллиметрового диапазона очень сильно поглощается молекулами воды [1], которые в свою очередь входят в состав любого живого организма и любой питательной среды. Исследования действия СВЧ-излучения на микроорганизмы показало, что оно оказывает влияние на: морфологию клеток, процесс клеточного деления, ряд биологических свойств бактерий, скорость роста (выход биомассы), выход ферментов в среду. При этом отсутствовал мутагенный эффект [7].
Первоначально считалось, что в основе механизма СВЧ-излучения лежит воздействие на информационные процессы в клетке, проводя аналогию с радиоэлектроникой. И уже тогда считалось, что СВЧ-излучение влияет на процессы мембранного транспорта за счет изменения примембранных слоев воды. Резюме о представлениях того и настоящего времени написано в обзоре [5] и работе [3].
Дрокина Т. В. и др. [2] показали, что СВЧ-излучение миллиметрового диапазона обладает выраженным стимулирующим эффектом (в 1000 раз выше, чем в контроле) в отношении люминесценции бактерий P. Leiognathi, находящихся в логарифмической фазе развития и сохраняющихся до 3 суток.
В общем и целом современное представление о механизме воздействия электромагнитного излучения на живые объекты показано в работе [5]. Согласно приведенной гипотезе, при воздействии излучением миллиметрового диапазона на микроорганизмы, энергия излученияне только поглощается молекулами воды и/или другими молекулами, но и может аккумулироваться путем структурных перестроек на гидрофильной поверхности с вытеснением протонов из приповерхностных слоев. Таким образом, образуется градиент в виде Δμн+, который в свою очередь может расходоваться на синтез АТФ с помощью протонных ATP-синтаз, что внешне проявляться как увеличение энергетического обмена в микроорганизмах и соответственно увеличение скорости роста. В связи с тем, что чем больше поглощается энергии системой, тем больше становится толщина адсорбированных слоев воды и тем больше возникает градиент протонов, что проявится в виде угнетения при избыточном облучении за счет развития оксидатного стресса.
Последние исследования влияния электромагнитного излучения оптического и инфракрасного диапазона на воду, находящуюся на границе фаз, показали, что широкие макроскопические области жидкости на границе фаз приобретают свойства, отличные от обычной объемной воды [6].
Однако непосредственное исследование воздействия излучения миллиметрового диапазона, с точки зрения адсорбции слоев молекул воды на поверхности раздела фаз, не были проведены.
В работе [4] рассмотрены возможности использования КВЧ-излучения в фармации, в частности при проведении технологических процессов с использованием микроорганизмов.
В данной работе приведены экспериментальные данные об изменении люминесценции индикаторного штамма E. colilum+ оптической плотности питательной среды MRS-1, используемой для культивирования лактобактерий.
Гипотеза молекулярного механизма воздействия СВЧ-излучения на микроорганизмы, предложенная в [5], говорит, что СВЧ-излучение на резонансных частотах поглощается молекулами воды, что приводит к перестройке электронных плотностей и разделению зарядов и, как следствие, образованию упорядоченных макроскопических структур в виде многослойной сетки диполей на гидрофильных поверхностях.
Материалы и методы
Подготовка проб
Питательная среда MRS-1, используемая в эксперименте, была изготовлена из 10,0 пептона, 20 мл дрожжевого экстракта, 20,0 глюкозы, 1мл твина-80, 2,0 калия фосфорно-кислого двузамещенного, 5,0 натрия ацетата, 2,0 триаммония цитрата, 0,2 сульфата магния, 0,05 сульфата марганца (MgSO4∙4H2O), доведена до 1л водой и простерилизована, pH = 6,2 при Т = 25 °С. Перед использованием воды для приготовления питательной среды проводили водоподготовку до требований ФС 42-2619-89 «Вода очищенная».
Подготовка к проведению измерений биолюминесценции включала регидратацию и приготовление рабочего разведения лиофилизированного индикаторного штамма люминесцентных бактерий (проба) E. colilum+ с помощью воды очищенной имеющей рН 7,0±0,2 и охлажденной до температуры (6±2) °С. Затем разведенную индикаторную культуру выдерживали не менее 30 мин при температуре (22±2) °С.
Измерение оптической плотности
Было проведено измерение оптической плотности на спектрофотометре СФ-103 НПКФ «АКВИЛОН» (Россия). Измерения проводили при комнатной температуре.
Экспериментальная установка
Рис. 1. Схема установки для облучения проб СВЧ-излучением с λ=5,6 мм и 4,9 мм
На рис. 1 изображена схема установки для облучения проб СВЧ-излучением с длиной волны λ=5,6 и 4,9 мм. В качестве генератора 1 был использован аппарат «МИЛТА-КВЧ» НПО «Космического приборостроения» (Россия) с выходной мощностью 10 мВт. СВЧ-излучение (волна Н11) распространялось по волноводу круглого сечения 2 и в виде расходящейся волны облучало пробирку с пробой 3. Расстояние между раскрывом волновода и пробиркой было выбрано порядка 1 см, что, с одной стороны, обеспечивало работу в дальней зоне 
, где d – диаметр раскрыва волновода, для λ=5,6 мм d=4,5 мм и R=7,2 мм; для λ=4,9 мм d=4,0 мм и R=6,5 мм, с другой стороны, пробирка находилась внутри сечения СВЧ-пучка на уровне половинной мощности, которое, по нашим расчетам, составляло порядка 1 см. Вектор напряженности электрического поля 
был ориентирован горизонтально.
Измерение биолюминисценции
Определение биолюминесценции под воздействием излучения в отношении энтеробактерий проводили с помощью экспресс-теста ингибирования биолюминесценции индикаторного штамма Escherichiacolilum+. Уровень гашения (стимуляции) свечения индикаторной культуры определяли с помощью люминометра «Биотокс-6» ООО «НЕРА-С» (Россия), через фиксированные промежутки времени после облучения: 10 мин, 1, 2, 3, 4, 5 и 24 ч. Обработку данных проводили с помощью программного обеспечения MSExcel.
Результаты и обсуждения
Данный эксперимент является продолжением более ранних исследований влияния электромагнитного излучения на околоповерхностные слои воды, которые показали, что энергия излучения может аккумулироваться в виде энтропии потерь и разделения зарядов только при наличии гидрофильной поверхности и воды. В ходе облучения происходит интенсивный рост толщины адсорбированных молекул воды на поверхности, причем зоны вырастают большей толщины, чем без излучения [8].
Чтобы проверить, что ключевую роль в процессе воздействия ЭМИ миллиметрового диапазона на микроорганизмы играют молекулярные перестройки на гидрофильныхповерхностях, была измерена оптическая плотность питательной среды MRS-1 сразу после облучения. Другим экспериментом, подтверждающим правоту модели, приведенную в работе [5], служило исследование биолюминесценции тест-штамма E.colilum+.
В опыте, с облучением питательной среды, проведенном нами, гидрофильными поверхностями выступали стенки кварцевой кюветы, а также поверхности молекул гидрофильных веществ, входящих в состав питательной среды MRS-1.
Известно, что λ=4,9 и 5,6 мм являются резонансными частотами поглощения в жидкой воде [6].
После облучения СВЧ-излучением на λ=4,9 и 5,6 мм наблюдается резкое снижение оптической плотности в УФ-диапазоне (рис. 2), что говорит о том, что среда становится более прозрачной для УФ-диапазона. Данное явление может происходить только за счет коллективного эффекта. Стоит отметить, что спектры поглощения питательной среды, облученной λ=4,9 и 5,6 мм, практически идентичны, что говорит об одинаковых процессах, происходящих в среде под действием этих длин волн. На спектре отчетливо видно, что пики поглощения, соответствующие λ=234, 252 и 264 нм, практически исчезают после облучения. Небольшие пики в контроле на λ=243 и 352 нм также незначительны после облучения.
Рис. 2. Спектр поглощения питательной среды MRS-1 в УФ-диапазоне
Возможным молекулярным механизмом данного явления считается то, что молекулы становятся более поляризованными, а среда в целом становится более упорядоченной и ввиду этого приобретает свойства жидкого кристалла [10]. Другими словами, энергия излучения миллиметрового диапазона, поглощаясь молекулами, смещает их электронную плотность, повышает дипольный момент молекул, главным образом воды, усиливает водородные связи и приводит к молекулярным перестройкам на гидрофильных поверхностях.
Перетекание отрицательного заряда к поверхности вынуждает молекулы к переходу. Если частота электромагнитного излучения совпадает с собственной частотой колебательных переходов молекул воды, то этот эффект усиливается, что вызывает многоквантовые переходы между колебательными уровнями симметричной и ассиметричной мод через деформационную моду [6]. Перераспределенная электронная плотность запускает многослойную адсорбцию на гидрофильных поверхностях и уплотняет упаковку молекул воды с исключенными из себя растворенными веществами и ионами Н+, что приводит к повышению колебательного возбуждения внутри сетки. Это означает, что электроны в адсорбированных слоях воды гораздо менее связаны, т.е. находятся в возбужденном состоянии, чем электроны вне зон многослойной адсорбции и, следовательно, для переизлучения квантов требуется меньше энергии, что и видно как снижение оптической плотности в спектре УФ-диапазона.
Измерение уровня люминесценции проб показало значительное повышение свечения относительно контроля (рис. 3). Более выраженное воздействие на люминесценцию оказало излучение с λ=4,9 мм (в первые десять минут после облучения уровень поднялся на 85 %), чем при облучении пробы с λ=5,6 мм. Эффект стимуляции оставался на протяжении всего эксперимента и оставался стабильным после 3 часов для λ=4,9 на уровне 31 %. При облучении на λ=5,6 было увеличение уровня свечения до 55 % по сравнению с контролем, который аналогично падал в течение 3 часов, однако в сравнении с пробой, подвергшейся облучением на λ=4,9, уровень люминесценции после 3 часов начал расти и через 24 часа достиг первоначальной отметки 55 %.
Основываясь на мультиферментной модели строения и функционирования бактериальной люциферазы, приведенной в статье [9], эмиссия фотонов происходит благодаря возбуждению «эмиттера» за счет отдачи протона и двух электронов от FMNH2. Таким образом, при воздействии СВЧ-излучения, вытесненные протоны из адсорбированных слоев воды на гидрофильной поверхности α-спирали люциферазы взаимодействуют с FMN и образуют FMNH2, что, в свою очередь, и приводит к протеканию реакции свечения.
Рис. 3. Влияние СВЧ-излучения на биолюминесценцию E. colilum+.
Время экспозиции 60 мин
Заключение
Результаты исследования согласуются с результатами других авторов и показывают, что в основе воздействия СВЧ-излучения на живые организмы лежит влияние на процесс адсорбции и десорбции молекул воды на гидрофильных поверхностях.
Таким образом, обработка СВЧ-излучением на резонансных частотах культур микроорганизмов может привести как к положительным (стимуляция роста культуры), так и отрицательным (ингибирующей эффект) последствиям, что зависит от времени экспозиции, режима и мощности излучения. Также результат будет зависеть от конкретного микроорганизма, состава питательной среды, кислотности и внешних условий.
Благодарности
Выражаю благодарность моему научному руководителю, проф. Т.Ф. Одеговой, сотрудникам ФАРМАТЕСТ, зав. кафедрой токсикологической химии Т.Л. Малковой за предоставленное оборудование, начальнику отдела бактериотерапии В.А. Несчисляеву и Директору Филиала ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России «Пермское НПО «Биомед» А.В. Казьянину, а также рецензентам.
Рецензенты:
Ростова Наталья Борисовна, доктор фармацевтических наук, профессор, должность – профессор, ГБОУ ВПО Пермская государственная фармацевтическая академия Росздрава, г. Пермь.
Гейн Владимир Леонидович, доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедрой физколлоидной химии, ГБОУ ВПО Пермская государственная фармацевтическая академия Росздрава, г. Пермь.