Введение
Возможна ли связь между хламидийной инфекцией и злокачественным ростом? В соответствии с данными ряда авторов [3,4,5], это в достаточной степени вероятно. Однако глубокого изучения течения злокачественных новообразований, протекающих на фоне хламидийной инфекции, не проводилось. Малочисленны экспериментальные данные о влиянии возбудителя на рост и развитие злокачественных опухолей. Вместе с тем можно предположить, что сочетанное поражение макроорганизма опухолевым процессом и возбудителем хламидиоза может привести к более глубоким нарушениям барьерных систем организма и, прежде всего, иммунологического звена защиты, что, в свою очередь, значительно осложнит течение основного заболевания, повлияет на результаты его лечения и прогноз.
Целью настоящего исследования явилось изучение влияния хламидийной инфекции на особенности роста и развития злокачественной опухоли в эксперименте.
Материалы и методы. В эксперименте использовано 200 белых нелинейных крыс с исходной массой тела 170-200 г. В связи с поставленными в эксперименте задачами животные были разделены на следующие группы:
1 опытная - животные с поэтапным введением двух культур - С-45 и Chlamуdia trachomatis (130 крыс);
2 опытная - животные с одновременным введением двух культур - С-45 и Chlamуdia trachomatis (40 крыс);
Контролем служили животные с перевитой традиционно С-45 без инфекционного компонента (85 крыс).
Экспериментальное заражение лабораторных крыс культурой Chlamуdia trachomatis проводили интраназально и в половой аппарат. В исследовании использован штамм Е Chlamуdia trachomatis, как один из сероваров, наиболее распространенных у лиц с генитальной инфекцией и характеризующийся наиболее оптимальной функциональной активностью и низкой частотой мутаций [6]. Инфицирование осуществляли очищенной хламидийной взвесью Chlamуdia trachomatis с титром - 106IFU / мл. Хламидии были выращены роллерным культивированием в клеточных линиях McCoy. Объем вводимой дозы инокулята определялся из расчета 1 мкл на 1 г массы тела [7]. Число включений хламидий определяли методом прямой иммунофлюоресценции.
Инфицирование культурой Chlamуdia trachomatis выполнялось предварительно (через 16 дней после инокуляции Chlamуdia trachomatis крысам перевивали опухолевый материал - поэтапное введение) или параллельно (одновременное введение) с перевивкой этим животным опухолевого штамма саркомы С-45.
Экспериментальную опухоль перевивали в стерильных условиях дозировано по общепринятой методике [1] путем подкожного введения 0,5 мл гомогенной взвеси опухолевых клеток в физиологическом растворе (разбавление ткани 1:1).
На этапах опухолевого роста провели определение: частоты и сроков появления опухолей, объемов опухолей по формуле Шрека (Vоп=a х b х c х π/6, где Vоп - объем опухоли, a, b, c - ее высота, длина и ширина), удельной скорости роста опухолей и показателей выживаемости животных.
Средняя удельная скорость роста опухоли является интегральным показателем, характеризующим ее рост на определенном интервале времени [2], и рассчитывается по формуле:
F(t2)
(t1t2) = ln--------------- , где
F(t1)
F (t1) - объем опухоли в начале интервала;
F (t2) - объем опухоли в конце интервала;
t2 - t1 - продолжительность интервала наблюдений (временной интервал).
Статистический анализ результатов проводили с помощью пакета Statistica 6,0 (Stat-Soft, 2001). Оценка достоверности произведена с использованием t-критерия Стьюдента. Уровень Р<0,05 принимали как значимый.
Результаты и обсуждение
Согласно полученным результатам, первые опухоли были визуализированы в 1 опытной группе животных, в которой перевивка опухолевого материала проводилась после предварительного инфицирования культурой хламидий (табл.1). Обратило внимание значительное сокращение сроков «выхода» и высокая частота образования опухолей. Морфологически подтвержденные опухоли размерами с большую фасоль определялись на месте введения опухолевого субстрата у 81,5 % животных уже на 3-и сутки от начала перевивки. На 4-й день появление опухолей отмечено еще у 13,8 % животных, на 5-й - у оставшихся 4,6 % крыс. Итак, уже к 5-м суткам перевивки у всех животных, предварительно инфицированных Chlamydia trachomatis, зарегистрированы злокачественные опухоли.
У крыс 2 опытной группы с одновременным введением опухолевого и инфекционного материалов появление первых опухолей зафиксировано на 4-й день после перевивки у 17,7 % животных. В последующие дни - 5-й, 6-й, 7-й, 8-й и 9-й опухоли определялись с частотой: 12,5 % (у 5 крыс); 10,1 % (у 4-х); 14,8 % (у 6); 2,5 % (у 1); 25,0 % (у 10) соответственно. На 10 день эксперимента все животные этой группы имели опухоли.
В 1 контрольной группе крыс с перевивной С-45 появление опухолей зарегистрировано только на 7-й день после перевивки у 15,6 % животных, на 8-й день - у 21,1 %, что составило 36,7 % от начала эксперимента. На 9-й день перевивки число животных с опухолями приблизилось к 60 %: опухоли выявлены у 22,5 % крыс, на 10-й день - у 30,2 %; на 11-й - у 5,5 %. К концу наблюдений частота новообразований в характеризуемой группе составила 94,4 %.
Итак, результаты оценки продолжительности латентного периода развития С-45 продемонстрировали, что опухоли с большой частотой и в более ранние сроки появлялись в группах животных с инфекционным компонентом с заметным опережением в группе с поэтапным воздействием двух агентов (опухолевого и инфекционного).
Таблица 1
Частота (%) и сроки развития опухолей в условиях экспериментальной хламидийной инфекции
|
Сроки развития опухолей (дни) |
Группы животных |
||
|
Животные - опухоленосители С-45 |
Животные с поэтапным введением культур С-45 и Cl.tr |
Животные с одновременным введением культур С-45 и Cl.tr |
|
|
3 |
|
81,5 (106) |
|
|
4 |
|
13,8 (18) 95,4 (124) |
17,7 (7) |
|
5 |
|
4,6 (6) 100,0 (130) |
12,5 (5) 30 (12) |
|
6 |
|
|
10,1 (4) 40,6 (16) |
|
7 |
15,6 (14) |
|
14,8 (6) 55,2 (22) |
|
8 |
21,1 (19) 36,7 (33) |
|
2,5 (1) 57,7 (23) |
|
9 |
22,5 (20) 58,89 (53) |
|
25,0 (10) 82,7 (33) |
|
10 |
30,2 (27) 88,88 (80) |
|
17,3 (7) 100,0 (40) |
|
11 |
5,5 (5) 94,4 (85) |
|
|
Примечание: первая строка - количество животных (%), давших рост опухоли в каждый из дней;
вторая строка - суммарное количество животных (%), давших рост опухоли;
в скобках указано абсолютное количество животных.
В табл. 2 представлены результаты, отражающие динамику изменения объемов опухолей С-45 при различных условиях инфицирования животных хламидийной инфекцией.
Таблица 2
Динамика изменения объемов опухоли в условиях экспериментальной хламидийной инфекции
|
Этапы исследования |
Животные-опухоленосители С-45 |
Животные с поэтапным введением культур |
Животные с одновременным введением культур |
|
|
1 |
2 |
3 |
||
|
Выход опухоли |
см3 |
0,96±0,2 (0,70-15) |
1,06±0,09 |
0,99±0,12 (0,82-1,28) |
|
% |
100 |
100 |
100 |
|
|
Через 4 суток |
см3 |
2,84±0,20 (1,75-3,58) р1<0,001 |
4,11±0,32 р1<0,001 р4<0,001 |
3,71±0,30 (2,62-5,19) р1<0,001 р4<0,05 |
|
% |
293,5±5,65 (210,8-373,4) |
392,7±8,3 (350,2-453,6) р4<0,001 |
378,8±8,6 (324,3-435,5) р4<0,001 р5<0,05 |
|
|
Через 8 суток |
см3 |
3,65±0,20 (2,65-4,37) р1<0,001 |
5,00±0,41 (4,01-6,59) р1<0,001 р4<0,05
|
5,93±0,42 (4,11-7,21) р1<0,001 р2<0,001 р4<0,001 р5<0,05 |
|
% |
377,7±5,42 (319,3-427,2) р2<0,001 |
477,5±7,22 (446,8-537,6) р2<0,001 р4<0,001
|
596,0±6,7 (501,2-643,1) р2<0,001 р4<0,001 р5<0,001 |
|
|
Через 12 суток |
см3 |
4,49±0,09 (3,35-5,31) р1<0,001 р3<0,05 |
6,44±0,50 (5,15-9,43) р1<0,001 р2<0,01 р3<0,05 р4<0,01
|
8,55±0,82 (6,50-12,6) р1<0,001 р2<0,001 р3<0,001 р5<0,05 |
|
% |
465,5±6,7 (402,4-548,6) р2<0,001 р3<0,001 |
610,0±10 (643,2-795,5) р2<0,001 р3<0,001 р4<0,001
|
862,3±10 (654,6-911,5) р2<0,01 р3<0,001 р4<0,001 р5<0,05 |
|
Примечание:
р1 - достоверность различий по отношению к исходным данным;
р2 - достоверность различий по отношению к данным 4-х суток;
р3 - достоверность различий по отношению к данным 8-х суток;
р4 - достоверность различий по отношению к животным-опухоленосителям С-45;
р5 - достоверность различий по отношению к животным с поэтапным введением культур.
Данные свидетельствовали, что животные с инфекцией характеризовались наибольшими объемами опухолей на этапах обследования (4-й, 8-й, 12-й дни после выхода опухоли) и значительно превышали значения показателя в контрольной группе крыс с перевивной С-45. Различия составили: 44,8 %, 37,2 % и 43,3 % соответственно у животных с поэтапным и 30,7 %, 62,6 % и 90,2 % - у крыс с одновременным введением двух культур. Соответственно, в этих же группах более значительны объемы опухолей, выраженные в процентах к первоначальному объему (табл. 2).
Если в контрольной группе объемы опухолей составляли от 293,5 % до 465,5 %, то в группах с инфекционным компонентом они были значительно больше: от 392,7 % до 610,0 % - при поэтапном и от 378,8 % до 862,3 % - при одновременном воздействии двух агентов.
Вместе с тем обнаружено различие и между группами с инфекционным компонентом. Последнее выражается в тенденции к увеличению показателя в группе одновременного введения опухолевого и инфекционного материалов, более выраженной на 12 сутки от выхода опухоли. Выявленные различия статистически достоверны только на этом этапе (р<0,05) и не достоверны при сравнении данных 4-го и 8-го дней эксперимента. Резкое увеличение объема опухолей на 12 сутки мы связываем с развитием в этот период у крыс острого воспалительного процесса. По-видимому, наблюдаемый у животных потенцирующий эффект можно рассматривать как следствие токсического влияния инфекционного агента на состояние регуляторных систем, обеспечивающих противоопухолевую резистентность.
Для более полной характеристики изменения параметров опухоли под влиянием исследуемых факторов нами была рассчитана удельная скорость роста опухоли (табл. 3):
1-й интервал - перевивка С-45 - через 4 суток после перевивки;
2-й интервал - 4 сутки после перевивки опухоли до 8 суток;
3-й интервал - 8 сутки - 12 сутки после перевивки опухолевого материала.
В группе инфицированных животных характер изменения удельной скорости роста опухолей на 1-м и 2-м интервалах наблюдений носит ту же направленность, что и в группе животных без инфекционного компонента (в контрольной группе): с максимальным значением показателя на 1-м этапе и с последующим снижением - на 2-м. При этом обращает внимание большая степень выраженности изменений изучаемого показателя у животных с двойным воздействием. Так, скорость роста опухоли на 1-м этапе в группе крыс с поэтапным и одновременным введением культур выше значений показателя в контрольной на 26,4 % и 20 % соответственно. На 2-м этапе она резко снижается (в среднем в 6,7 раз), отличаясь от значений в контроле на 20,6 % в обеих группах.
Таблица 3
Удельная скорость роста экспериментальных опухолей крыс в условиях хламидийной инфекции
|
Группы животных |
Удельная скорость роста опухолей |
|||
|
j (t0, t4) 1-й интервал |
j (t4, t8) 2-й интервал |
j (t8, t12) 3-й интервал |
j (t0, t12) интервал: от начала воздействия до конца |
|
|
Животные-опухоленосители С-45 |
0,269 |
0,063 |
0,052 |
0,128 |
|
Животные с поэтапным введением культур |
0,340 р1<0,001 |
0,05 р1<0,05 |
0,063 |
0,151 р1<0,05 |
|
Животные с одновременным введением культур |
0,323 р1<0,001 |
0,05 р1<0,05 |
0,06 |
0,145 р1<0,001 |
Примечание: р1 - достоверность различий по отношению к животным-опухоленосителям С-45.
Далее, на 3-м интервале времени скорость роста опухоли вновь увеличивается в отличие от данных в контрольной группе и превышая значения в ней на 21,1 % и 13, 3 % в группе с поэтапным и одновременным введением культур соответственно (р<0.05).
При сравнении удельной скорости роста опухолей на всем интервале наблюдений (t0-t12) у животных анализируемых групп получено, что в группе крыс с инфекцией скорость роста опухоли статистически достоверно выше значений показателя в группе без инфекции, а именно; 0,151 и 0,128, соответственно (р<0,05).
Немаловажное значение для объективной оценки эффекта различных воздействий на экспериментальных животных имеют наблюдения за выживаемостью.
Максимальный показатель выживаемости отмечен у крыс-опухоленосителей без инфицирования. В группах с двойным воздействием (инфекционного и опухолевого) выявлено значительное, статистически достоверное снижение указанного показателя: на 29,8 % - при поэтапном, на 36,7 % - при одновременном воздействиях (р<0,001).
Таким образом, результаты проведенных экспериментальных исследований продемонстрировали глубокое влияние хламидийной инфекции на организм-опухоленосителя, проявляющееся в более раннем «выходе» опухолей, увеличении ее параметров, ускорении темпов роста опухоли и изменении сроков продолжительности жизни по сравнению с неинфицированными животными-опухоленосителями. Полученные результаты свидетельствуют о том, что патологический механизм хламидийной инфекции в отношении организма, пораженного опухолевым процессом, опосредованно потенцирует рост злокачественной опухоли.
Рецензенты:
Шихлярова Алла Ивановна, д-р биол. наук, профессор, главный научный сотрудник отделения биотерапии онкологических заболеваний Института аридных зон ЮНЦ РАН, г. Ростов-на-Дону.
Николаева Надежда Владимировна, д-р мед. наук, ассистент кафедры онкологии Ростовского государственного медицинского университета, г. Ростов-на-Дону.