Гуминовые кислоты обладают способностью связывать: тяжелые металлы [21], минералы [18] и микроорганизмы (Bacillus subtilis) [19]. Несмотря на это, гуминовые кислоты не используются в качестве адсорбента микотоксинов. Имеются лишь отдельные работы, показывающие, что гуминовые кислоты in vitro могут связывать дезоксиниваленол (ДОН) и зеараленон [22]. Получены также данные, показывающие способность гуминовых кислот (оксигумат) адсорбировать афлатоксин В1, причем эффекты оксигумата превосходят эффекты введения в рацион пивных дрожжей [20].
Целью нашего исследования явилось изучение возможности использования гуминовых кислот для профилактики микотоксикозов животных. Эксперимент провели на лабораторных животных (морские свинки) массой 450 ± 25 г, которые были разделены на 4 группы по 6 голов в каждой группе. Животным 1-й группы на протяжении 1 месяца в рацион вводили пшеницу, пораженную микотоксинами в следующих концентрациях: содержание Т-2 токсина составляла 1,04 мг/кг, дезоксиниваленона - 0,05 мг/кг, зеараленона - 0,2 мг/кг. Зерно задавалось без ограничения. В остальном рацион соответствовал нормам кормления морских свинок [1-3; 5; 10].
Животные 2-й группы также получали пораженную микотоксинами пшеницу и гуминовые кислоты в дозе 0,175 мг на 1 кг живой массы в течение 30 дней внутримышечно в составе препарата «Лигфол» (ООО «Лигфол», Россия). В остальном рацион соответствовал нормам кормления морских свинок. Животным 3-й группы вместе с пораженным микотоксинами зерном вводили гуминовые кислоты в дозе 0,2 мг на 1 кг живой массы 1 раз в сутки в течение 30 дней в составе препарата «Гумивал» (ООО «Лигфол», Россия), который смешивали с зерном, пораженным микотоксинами. В остальном рацион соответствовал нормам кормления морских свинок.
Контрольные животные получали стандартный рацион питания. Зерно, входящее в рацион, не содержало микотоксинов. По окончании эксперимента у животных из правого предсердия под наркозом была взята кровь для биохимических и гематологических исследований.
Количественное определение микотоксинов в корме проводили с помощью тест-систем Ridascreen (производство фирмы R-Biofarm, Германия). Содержание малонового диальдегида (МДА) определяли спектрофотометрическим методом измерения реагирующих с тиобарбитуровой кислотой соединений [14], активность каталазы определяли спектрофотометрически в реакции Н2О2 с молибдатом аммония [11], содержание a-токоферола и ретинола определяли методом жидкостной хроматографии на хроматографе «Милихром 4» (Россия), содержание холестерина, АсАТ, АлАТ, глюкозы, мочевины, общие липиды в сыворотке крови определяли с помощью тест-систем фирмы Lachema (Чехия).
Химический гемолиз эритроцитов индуцировали гипохлорной кислотой (HOCl) - одним из наиболее сильных индукторов, образуемых нейтрофилами с участием фермента миелопероксидазы. Суспензию эритроцитов (Ht 0,5%, изотонический 0,05 М натрий-фосфатный буфер) инкубировали в течение 30 минут при 22 °С с HOCl в концентрации, равной 1 мМ. Процесс гемолиза регистрировали в надосадочной жидкости по количеству вышедшего из разрушенных эритроцитов гемоглобина после центрифугирования суспензии (3000 g в течение 10 минут) по величине оптической плотности при длине волны 414 нм. За 100% гемолиза принимали количество гемоглобина, освободившееся при осмотическом гемолизе такого же количества эритроцитов в дистиллированной воде.
Общий белок определяли в сыворотке крови с помощью рефрактометра ИРФ-452 Б2М, (Россия); соотношение белковых фракций определяли спектрофотометрически турбидиметрическим методом [9].
Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты считали достоверными при уровне р<0,05.
Для диагностики степени повреждения микотоксинами внутренних органов исследовали сывороточную активность «маркерных» ферментов. Поступление вместе с кормом микотоксинов приводит к увеличению сывороточной активности аспартатаминотрансферазы (АсАТ) в 1,5 раза, аланинаминотрансферазы (АлАТ) в 3,1 раза, щелочной фосфатазы (ЩФ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в 5 раз, что свидетельствует о поражениях внутренних органов (таблица 1). Все эти ферменты внутриклеточные, и их появление в крови свидетельствует о лизисе клеток тканей. Для исключения поражения микотоксинами сердца мы провели анализ сывороточной активности креатинкиназы (КК). В нашем эксперименте активность креатинкиназы, при употреблении контаминированного микотоксинами корма, возрастает, однако этот показатель остается в пределах допустимых величин (таблица 1). Полученные нами экспериментальные данные свидетельствуют о поражениях микотоксинами внутренних органов, за исключением сердца. В патогенезе данных нарушений лежит цитотоксическая активность микотоксинов [16].
Введение гуминовых кислот внутримышечно или вместе с кормом достоверно снижает сывороточную активность АсАТ, АлАТ, ЩФ, ЛДГ и КК (таблица 1). Это свидетельствует о протективном действии гуминовых кислот. Причем протективные действия гуминовых кислот практически не зависят от способа их введения. Однако введение гуминовых кислот вместе с кормом оказывает более выраженный профилактический эффект. Исследование состояния про-антиоксидантного баланса в организме морских свинок при поступлении микотоксинов показало активацию процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ), о чем свидетельствует повышенное содержание в крови малонового диальдегида (МДА) и снижение антиоксидантной защиты. Наблюдается достоверное снижение содержания в крови витаминов Е и А и активности каталазы по сравнению с контролем (таблица 1).
Таблица 1 - Биохимические показатели крови морских свинок (M±m, n=6)
Показатели |
Контроль |
I опытная (микотоксикоз) |
II опытная (лигфол) |
III опытная (гумивал) |
|
АсАТ, (мккат/л) |
0,61±0,01 |
0,92±0,04# |
0,78±0,01* |
0,69±0,03* |
|
АлАТ, (мккат/л) |
0,43±0,02 |
1,34±0,02# |
0,81±0,02#* |
0,83 ±0,02#* |
|
ЩФ, (мккат/л) |
1,13±0,12 |
5,50±0,34# |
3,44±0,17#* |
2,23±0,17#* |
|
КК (мккат/л) |
0,42±0,06 |
0,97±0,06# |
0,79± 0,03#* |
0,47 ±0,05* |
|
ЛДГ (мккат/л) |
2,06±0,31 |
10,94±0,64# |
1,88±0,48* |
2,43±0,40* |
|
МДА, (мкмоль/л) |
4,98±0,27 |
10,38±0,96# |
6,53±0,11#* |
5,38±0,22* |
|
Каталаза (мкмоль/мл´мин) |
33,24± 2,45 |
17,02±6,61# |
75,87±2,03#* |
53,40±6,10#* |
|
Витамин Е, (мкг/мл) |
40,12± 1,24 |
20,57±1,22# |
29,50±2,76#* |
45,01±5,32* |
|
Витамин А, (мкг/л) |
3,1 ± 0,12 |
1,6±0,21# |
3,4±0,2* |
3,6±0,4* |
|
Рез-ть Эр, (% гемолиза) |
80,1±6,4 |
60,4±6,0# |
60,4±1,4 |
73,8±3,9* |
|
Общий белок (г/л) |
72,3±4,32 |
54,73±2,23# |
61,83±2,63* |
60,07±0,86* |
|
Альбумины (г/л) |
40,12 ±4,08 |
26,58±6,20# |
33,54±2,94* |
32,67±2,03* |
|
a-глобулины (г/л) |
7,79±0,82 |
9,50±1,70 |
4,27±0,25#* |
4,59±0,91#* |
|
b-глобулины (г/л) |
8,21±0,51 |
8,44±1,01 |
7,99±0,81 |
5,85±0,52#* |
|
g-глобулины (г/л) |
16,18±0,45 |
10,21±0,8# |
16,04±0,46* |
16,73±0,94* |
|
Альбумины/глобулины |
1,25±0,05 |
0,94 ±0,03# |
1,18±0,11* |
1,20±0,06* |
|
Мочевина (ммоль/л) |
5,6 ±0,91 |
9,46±0,86# |
8,37±1,23 |
8,26±1,03 |
|
Общие липиды (г/л) |
4,0±0,46 |
4,67±0,66 |
4,67±0,33 |
7,17±0,33* |
|
ЛПНП (г/л) |
2,08±0,13 |
3,03±0,06# |
2,53±0,20* |
2,47±0,14* |
|
Холестерин (ммоль/л) |
1,56 ± 0,37 |
2,99±0,23# |
1,73±0,18* |
1,61±0,11* |
|
Глюкоза (ммоль/л) |
3,58±0,47 |
6,66±0,15# |
6,36±0,45# |
6,97±0,66# |
|
Лейкоциты (* 109/л) |
6,2±0,4 |
7,8±0,1# |
6,1±0,2 |
6,9±0,3 |
|
Эритроциты (* 1012/л) |
6,0±0,3 |
5,3±0,4 |
5,7±0,3 |
6,1±0,1* |
|
Гемоглобин (г/л) |
119, 6±4,4 |
94,3±4,4# |
117,7±6,5* |
139,1±5,6#* |
|
Цветной показатель |
0,60±0,01 |
0,53±0,04 |
0,58±0,03 |
0,68±0,01* |
|
Гематокрит (%) |
60±2 |
74±6# |
78±5# |
81±3# |
*-Р < 0,05 по сравнению с больными животными;
#-Р < 0,05 по сравнению с контролем.
Введение гуминовых кислот снижает интенсивность ПОЛ. Следует отметить, что введение гуминовых кислот вместе с кормом снижает содержание МДА до контрольных величин. Аналогичные результаты мы наблюдаем и в отношении антиоксидантной системы. Введение гуминовых кислот вместе с пораженным кормом нормализует содержание антиоксидантных витаминов А и Е и более значительно стимулирует активность каталазы по сравнению с внутримышечным введением гуминовых кислот (таблица 1). Это объясняется способностью гуминовых кислот связывать микотоксины в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) [6; 7]. Связывание гуминовыми кислотами микотоксинов снижает их поступление из ЖКТ в кровь и уменьшает активацию ПОЛ в тканях. Антиоксидантное действие гуминовых кислот можно также объяснить наличием в них в виде примесей микроэлементов Fe, Zn, Cu, Mg, Se и др., которые являются коферментами основных антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы). Антиоксидантные свойства гуминовых кислот, при внутримышечном введении, можно объяснить наличием в их молекулах хинонных групп. Антиоксиданты снижают повреждение внутренних органов свободными радикалами, которые образуются при поступлении микотоксинов в организм [8; 13; 16]. Активация свободнорадикальных процессов в результате поедания кормов, пораженных микотоксинами, приводит к повышению кислотной резистентности эритроцитов, о чем свидетельствует снижение процента гемолиза эритроцитов (таблица 1). Немедленная реакция эритроцитов на изменение интенсивности ПОЛ при поступлении в организм микотоксинов характеризует высокую степень участия этих клеток не только в гемореологии, но и в системе антиоксидантной защиты [7]. Эритроцитарное звено первым реагирует на изменение активности свободнорадикального окисления в крови при употреблении корма, пораженного микотоксинами.
Введение гуминовых кислот снижает активность ПОЛ и нормализует физические свойства мембран эритроцитов. Наибольшая эффективность наблюдаются при введении гуминовых кислот вместе с пораженным кормом. При микотоксикозе наблюдается достоверное снижение содержания общего белка в крови (таблица 1). Помимо снижения содержания белка, в нашем эксперименте наблюдается и изменение соотношение белковых фракций. Происходит снижение соотношения альбумины/глобулины. Снижение содержания в крови альбуминов происходит в результате их утилизации ретикуло-эндотелиальной системой при модификации их микотоксинами, так как большинство попавших в кровь веществ, в том числе и микотоксины, фиксируются на альбуминах независимо от того, являются они нейтральными, кислыми или основными соединениями [4; 16]. Нами показано достоверное, по сравнению с контролем, снижение содержания альбумина и γ-глобулинов в сыворотке крови. Также наблюдается увеличение содержания мочевины в сыворотке крови. Согласно литературным данным, это характерно для избыточного поступления азотсодержащих веществ вследствие усиленного распада тканевых белков [4].
Введение гуминовых кислот приводит к увеличению содержания общего белка в крови. Изменяется соотношение белковых фракций. Достоверно повышается содержание альбуминов и γ-глобулинов и снижается содержания α- и β-глобулинов (таблица 1). Содержание мочевины в сыворотке крови при этом снижается незначительно. Это можно объяснить усиленным распадом белка в процессе репарации тканей, поврежденных микотоксинами [4]. Таким образом, одним из механизмов терапевтического действия гуминовых кислот является нормализация белкового обмена. Это связано с детоксикационными, гепатопротективными и антиоксидантными эффектами гуминовых кислот. Увеличение количества g-глобулинов в крови мы связываем с уменьшением повреждения микотоксинами иммунокомпетентных клеток. Так, при микотоксикозах в первую очередь повреждается иммунная система организма [16]. При поступлении микотоксинов наблюдается достоверное увеличение содержания холестерина и липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) в сыворотке крови. Содержание общих липидов при этом увеличивается незначительно (таблица 1). Данные изменения мы связываем с активацией процесса ПОЛ и адаптивными изменениями к окислительному стрессу [7; 8].
Введение гуминовых кислот снижает содержание холестерина и ЛПНП (таблица 1). Данные результаты объясняются нами антиоксидантным действием гуминовых кислот. Содержание общих липидов незначительно увеличивается, по сравнению с контролем, и не изменяется, по сравнению с группой, получавшей корм, пораженный микотоксинами. Увеличение общих липидов в данной группе происходит за счет фосфолипидов и нейтральных липидов, так как содержание холестерина и ЛПНП при введении гуминовых кислот уменьшается. Это указывает на улучшение липидного, и в особенности фосфолипидного обменов, что объясняет наши данные об изменении физических свойств мембран эритроцитов.
При поедании корма, пораженного микотоксинами, увеличивается содержание глюкозы в крови. Однако эта величина находится в пределах физиологической нормы. Введение гуминовых кислот не изменяет уровень глюкозы в крови (таблица 1).
В нашем эксперименте при попадании микотоксинов в организм наблюдается незначительное снижение количества эритроцитов, содержания гемоглобина и уменьшение цветного показателя (ЦП). Гематокрит при этом увеличивается (таблица 1). Данные изменения объясняются увеличением гибели эритроцитов при поражении их микотоксинами и нарушением эритропоэза [7; 17].
Применение гуминовых кислот улучшает физиологические показатели крови. Наблюдается увеличение содержания гемоглобина, количества эритроцитов, цветного показателя и гематокрита (таблица 1). Нормализация гематологических показателей при применении гуминовых кислот, на наш взгляд, связана с уменьшением повреждения почек, печени и нормализацией минерального состава крови [6; 8].
При поступлении микотоксинов с кормом наблюдается увеличение содержания лейкоцитов (таблица 1). Повышение содержания лейкоцитов мы связываем с активацией процесса некроза в гепатоцитах, вызванного как окислительным стрессом, так и прямым воздействием микотоксинов на гепатоциты [4; 8; 16]. Введение гуминовых кислот снижает количество лейкоцитов, что может свидетельствовать о снижении воспалительных процессов в организме [4].
Таким образом, на основании полученных нами и литературных данных можно сделать вывод, что гуминовые кислоты способны адсорбировать и выводить микотоксины из желудочно-кишечного тракта, тем самым снижая процесс накопления их в организме. Помимо этого, на основании полученных нами данных можно сделать вывод, что гуминовые кислоты способны взаимодействовать с микотоксинами в организме и снижать повреждение внутренних органов при их внутримышечном введении, что дает возможность использовать их для лечения микотоксикозов.
Так как, согласно литературным данным, микотоксины способны аккумулировать в организме и оказывать свое токсикологическое действие при нахождении их в кормах в концентрации ниже ПДК [16], использование гуминовых кислот для профилактики микотоксикозов снизит затраты на лечебные и профилактические мероприятия, позволит улучшить продуктивные показатели и повысит рентабельность животноводства [6-9; 15].
Рецензенты:
Беляев В.А., доктор ветеринарных наук, декан факультета ветеринарной медицины ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет», г. Ставрополь.
Лысенко И.О., доктор биологических наук, заведующий кафедрой экологии и ландшафтного строительства ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет», г. Ставрополь.