Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

ENZYME PANCREATINE IMMOBILIZATION INTO COMPOSITE MATERIALS AND DEVELOPMENT ON THEIR BASIS TEST-SYSTEMS FOR DETECTION OF CU2+ IONS RESIDUES

Vorobeva O.V. 1 Filippova A.M. 1 Avanesyan S.S. 1
1 FSAEI of HPE North Caucasian Federal University
The way of enzyme pancreatine immobilization into composite materials on the basis of natural polymers is de-veloped. There are presented the data showing the change of the specific activity of the immobilized enzyme with and without Cu2+ ions. It is shown that the specific activity of the immobilized enzyme is reduced with Cu2+ ions present. As a matter of record a test-system for detection of Cu2+ ions in environment objects is created. It is proved that associated cadmium, iron and lead ions do not interfere with Cu2+ ions determining by means of the test-system developed. The developed biosensor test-system is evaluated on model systems. The test system de-termines the Cu2+ ions concentrations in the range from 0.02 mg/lto 1.45 mg/l. The test-system on the basis of the immobilized enzyme pancreatine is easy in use, do not need expensive equipment and specially trained staff.
Cu2+ ions
enzyme
specific activity
inhibitor
pancreatine
immobilization
test-system

Введение

На сегодняшний день проблема загрязнения окружающей среды имеет приоритетное социальное и экономическое значение. Отходы производства: газообразные, жидкие и твердые вещества, поступающие в окружающую среду из различных источников, вызывают деградацию среды обитания и наносят ущерб здоровью населения [5].

В качестве токсикантов, нарушающих жизнедеятельность водных организмов и человека, могут выступать ионы тяжелых металлов. Так в результате прямого окисления сульфидов меди кислородом воздуха или сульфатредуцирующими бактериями происходит загрязнение природных гидросистем токсичными ионами меди. Миграция меди в природных поверхностных и грунтовых водах связана с высокой подвижностью ее иона в сульфатных средах [4]. Источником солей меди могут выступать сельхозугодия, регулярно обрабатываемые медьсодержащими ядохимикатами (например, бордосской жидкостью).

Ферментативные методы анализа являются перспективным направлением в диагностике окружающей среды при проведении эколого-аналитического мониторинга. Высокая селективность и чувствительность к ингибиторам ферментов – загрязнителям окружающей среды является основанием для создания на их основе тест-систем с такими параметрами как: простота и удобство в применении, высокая чувствительность и надежность [3]. Работы по созданию тест-систем на основе иммобилизованных ферментов актуальны и востребованы. Все большее количество ферментов используется при получении уникальных устройств, детектирующих наличие ингибиторов в различных объектах окружающей среды [2].

Цель исследования: разработка тест-системы для обнаружения остаточных количеств ионов меди в объектах окружающей среды на основе высокомолекулярного композиционного материала с иммобилизованным ферментом панкреатином.

Материалы и методы исследования

Для определения амилазной активности растворимого и иммобилизованного фермента панкреатина применяли метод, основанный на использовании в качестве субстрата полисахарида. Суть разработанного метода определения амилазной активности панкреатина состоит в следующем: к 0,1 мл раствора фермента панкреатина (15 мг в 500 мл дистиллированной воды) добавляли 1,6 мл фосфатного буферного раствора (рН 6,9) и термостатировали 30 минут при температуре 37 ℃. Параллельно термостатировали 0,1 %-й раствор крахмала, используемого в качестве субстрата, в 0,9 %-ом растворе хлорида натрия. Для постановки ферментативной реакции к анализируемому раствору панкреатина добавляли 1 мл 0,1 % -го раствора крахмала в 0,9%-ом растворе хлорида натрия, смесь инкубировали в течение 5 минут при температуре 37 ℃. В качестве контроля использовали смесь, в состав которой вместо раствора фермента вносили 0,1мл 0,9 %-го раствора хлорида натрия. Ферментативную реакцию останавливали, добавляя 0,1 мл 1М раствора соляной кислоты. Остаточное количество крахмала оценивали по сине-фиолетовой окраске с раствором йода на ФЭК–КФК-2 при длине волны 670 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Затем, исходя из оптической плотности, определяли количество крахмала в растворе и рассчитывали удельную активность фермента. Количество расщепленного крахмала определяли по разности экстинкции контрольной и опытной проб с учетом калибровочной кривой в координатах оптическая плотность / количество крахмала (мг).

Активность рассчитывали по формуле:

(1)

мг крахмала/г фермента, где mкр – масса расщепленного крахмала, мг; mф – масса фермента, мг;1000 – единица перевода мг в г.

Для иммобилизации фермента панкреатина в структуру композиционного материала была разработана следующая методика. Готовили 3 %-й раствор метилцеллюлозы в воде, выдерживали в течение 12–15 часов. В полученный коллоидный гель метилцеллюлозы вводили реагент для модификации реологических характеристик, 0,03 %-й водный раствор фермента панкреатина, пластификатор и перемешивали до однородного состояния [1].

Моделирование процесса влияния различных факторов на удельную активность ферментов ацетилхолинэстеразы и панкреатина проводилось с помощью программы Statistic V.6 с привлечением метода искусственные нейронные сети (NeuralNetworks).

Результаты исследования и их обсуждение

В основе тест-системы для обнаружения ионов Cu2+ в объектах окружающей среды лежит ферментативная реакция с участием фермента панкреатина.В связи с этим, создание оптимальных условий при использовании данной тест-системы предполагало исследование таких факторов, как температура, рН буферного раствора, время ингибирования и время ферментативной реакции.

Для анализа использовали пять экспериментальных серий препарата иммобилизованного фермента панкреатина. Исследуемые пробы имели состав: 1 мл 0,1%-го раствора крахмала в 0,9 %-ом растворе хлорида натрия; 1,6 мл фосфатного буферного раствора (рН = 6,9). В одни пробы добавляли по 0,1 мл раствора композиционного материала (композиционный материал массой 36 мг, содержащий фермент панкреатин массой 0,3 мг, растворяли в 10 мл дистиллированной воды). В другие пробы добавляли по 0,1 мл раствора растворимого фермента (15 мг в 500 мл дистиллированной воды). В опытную пробу добавляли 1 мл 0,0001 %-ого раствора CuSO4 в начале реакции, а в контрольную – в конце реакции. Полученные образцы термостатировали 5 минут при температуре 37 ℃.

Полученные данные представлены в таблице 1.

Таблица 1. Оптимизация факторов и анализ активности растворимого и иммобилизованного фермента панкреатина

Наименование показателя

Фермент, иммобилизованный в композиционный материал

Фермент без носителя

Удельная активность,

(мг крахмала/г фермента)×105

2,73

2,80

Сохранение удельной активности при иммобилизации, %

95-98

100

рН

6,9

6,9

Температура, ℃

37

37

Время ингибирования, мин

30

30

Время ферментативной реакции, мин

5

5

Важным аспектом является длительность сохранения каталитической активности ферментного препарата, заключенного в композиции. В этой связи образцы тест-систем хранились в течение 4 месяцев при температурах +4 ℃ и +20 ℃. При этом остаточную активность измеряли один раз в месяц. Для анализа использовали пять экспериментальных серий препарата иммобилизованного фермента панкреатина.

Полученные данные представлены на рисунке 1.

Рисунок 1. Сохранение ферментативной активности панкреатина во времени

Из полученной диаграммы можно сделать вывод: композиции, хранившиеся при температуре +4 ℃, к четвертому месяцу хранения имели стабильный процент сохранения биокаталитической активности, а композиции, хранившиеся при температуре +20 ℃, потеряли 78 % своей удельной активности.

Были проведены исследования по сохранению удельной активности иммобилизованного и растворимого фермента панкреатина во времени при температуре хранения +4 ℃ (рисунок 2).

Рисунок 2. Сохранение удельной активности иммобилизованного и растворимого фермента панкреатина во времени

Из графика видно, что к третьему месяцу хранения при температуре +4 ℃ иммобилизованный фермент сохранил 75 % активности, а фермент, находящийся в растворе, сохранил 8,4 % активности.

Полученные данные свидетельствуют о том, что при хранении иммобилизованный фермент предотвращает потерю активности по сравнению с ферментом, находящимся в растворе. Это может являться одним из преимуществ, при разработке тест-системы.

На основании полученных данных была разработана тест-система для обнаружения ионов меди в объектах окружающей среды следующего состава: композиционный материал массой 33 мг с иммобилизованным в его структуру ферментом панкреатином массой 0,003 мг.

Для разработки способа обнаружения меди была составлена модельная система, которая представляла собой образцы воды, содержавшие ионы меди в следующих количествах: 0,25 мкг; 2,5 мкг; 25 мкг; 125 мкг; 250 мкг и 375 мкг. Для анализа использовали шесть экспериментальных серий препарата иммобилизованного фермента панкреатина.

Анализ проводили в следующей последовательности. В анализируемую пробу объемом 2,75 мл помещали композиционный материал массой 33 мг с иммобилизованным ферментом массой 0,003мг и термостатировали 30 минут при +37 ℃. Затем прибавляли 1,6 мл буферный раствор (рН = 6,9) и 1 мл 0,1 %-го раствора крахмала, используемого в качестве субстрата. Смесь инкубировали в течение 5 минут. По истечении времени реакцию останавливали подкисленным раствором индикатора йода (раствор, приготовленный разведением в 50 раз 0,2N раствором соляной кислоты основного раствора, состав которого: 2 г йода, 0,66 г йодида калия в 20 мл воды). Содержание меди определяли количественно на ФЭК-КФК-2 при длине волны 670 нм в кювете толщиной 10 мм.

Полученные данные представлены на рисунке 3.

Рисунок 3. Определение ионов Cu2+ с помощью разработанной тест-системы на основе иммобилизованного фермента панкреатина

Анализ полученных данных позволил сделать вывод, что 125 мг меди полностью ингибируют 3 мкг фермента панкреатина. При наличии минимально определяемого количества меди в анализируемом растворе удельная активность иммобилизованного фермента панкреатина снижается на 14 %.

В связи с тем, что в объектах внешней среды наряду с ионами меди присутствуют ионы тяжелых металлов: кадмия, железа, свинца и др., было необходимо провести анализ по влиянию сопутствующих ионов на определение меди с использованием разработанных тест-систем. Концентрация вносимых ионов 10 мкг в 1 мл (рис. 4).

Рисунок 4. Влияние ионов тяжелых металлов на активность иммобилизованного фермента панкреатина

Из графика видно, что определению ионов меди с помощью разработанной тест-системы, не мешают ионы кадмия свинца и железа. Таким образом, данный метод обладает специфичностью в отношении ионов меди.

Заключение

С целью построения тест-системы для обнаружения остаточных количеств ионов меди была проведена иммобилизация фермента панкреатина в композиционные материалы и оптимизированы основные параметры, влияющие на проведение анализа: рН среды – 6,9; температура – 37 ℃; время ингибирования – 30 минут; время постановки ферментативной реакции – 5 минут. На основании результатов исследования установлено, что иммобилизованный фермент панкреатин, хранившийся при температуре +4 ℃, к четвертому месяцу сохранил 70 % каталитической активности, а хранившийся при температуре +20 ℃, потерял 78 % активности. Исследования по сохранению активности фермента во времени показали, что после 3 месяцев хранения фермент в растворе сохранил 10,1 % удельной активности, а иммобилизованный фермент сохранил 70 % удельной активности. На основе полученных данных разработана тест-система с иммобилизованным ферментом панкреатином для детекции ионов меди в объектах внешней среды.

Проведенные исследования показывают, разработанный метод обнаружения ионов Cu2+ с использованием тест-системы на основе фермента панкреатина, иммобилизованного в композиционные материалы, обладает специфичностью и высокой чувствительностью. Диапазон определяемых концентраций с помощью данной тест-системы составляет от 0,02 до 1,45 мг/л. При наличии минимально определяемой концентрации ионов меди удельная активность иммобилизованного фермента снижается на 14 %. Определению меди не мешают сопутствующие ионы кадмия, железа и свинца. Анализ позволяет проводить детекцию меди на уровне предельно допустимой концентрации меди в объектах внешней среды, а также не требует большого объема исследуемой пробы.

Рецензенты:

Орлова Ирина Георгиевна, доктор биологических наук, старший научный сотрудник по специальности, профессор кафедры медицинской биохимии, клинической лабораторной диагностики и фармации ФГАОУ ВПО «Северо-Кавказский федеральный университет», г. Ставрополь.

Лодыгин Алексей Дмитриевич, доктор технических наук, доцент, заведующий кафедрой прикладной биотехнологии ФГАОУ ВПО «Северо-Кавказский федеральный университет», г. Ставрополь.