Введение
Современные вопросы лесовозобновления и лесоразведения должны выполняться на генетико-селекционной основе [9, 4, 6 и др.]. Селекционными методами можно значительно повысить продуктивность и качество насаждений, повысить устойчивость лесных культур.
Практически во всех странах мира, отмечает Ю. П. Ефимов [4], основной формой организации семеноводства признаны лесосеменные плантации (ЛСП), создаваемые путем размножения отобранных в насаждениях плюсовых деревьев.
Согласно «Указаниям по лесному семеноводству в РФ» [7] постоянную лесосеменную базу составляют ЛСП, созданные из клонов или семей плюсовых и элитных деревьев, постоянные лесосеменные участки (ПЛСУ), плюсовые деревья, архивы клонов, географические и испытательные культуры. Лесосеменные плантации – специально создаваемые насаждения, предназначенные для массового получения в течение длительного времени ценных по наследственным свойствам семян лесных растений. При выборе способа закладки многие лесоводы-селекционеры отдавали предпочтение ЛСП вегетативного происхождения, т.к. у потомства в полной мере сохраняются наследственные свойства плюсовых деревьев [8]. При создании прививочных плантаций применяют разные способы прививки [4 и др.]. Однако для таких древесных пород, как ольха, приживаемость и сохранность прививок низкая [1 и др.]. Поэтому метод микроклонального размножения in vitro имеет большую перспективу.
Материал и методика
Материалом исследований были регенеранты in vitro и сеянцы ольхи черной (Alnus glutinosa (L.) Gaertn.) и ольхи серой (Alnus incana (L.) Moench.). У регенерантов и сеянцев проведены дендрометрические исследования их высоты, диаметра, ширины кроны, размеров шишек. Жизнеспособность пыльцы определяли методом окрашивания йод-хлоралгидратом [8]. Реактив готовится за 2 – 3 суток: 5 г хлоралгидрата смешивают с 2 мл дистиллированной воды, добавляют кристаллический йод – 0,2 г, настаивают. Этот метод основан на йодной реакции: обычно жизнеспособные пыльцевые зерна полностью заполнены крахмалом. Размеры пыльцы выполнены окуляр-микрометром на микроскопе МБИ-6, микрофотографии – на микроскопе Биолам Р – 15.
Результаты исследования и обсуждение
В Новоусманском лесхозе Воронежской области заложен опытный участок из регенерантов in vitro ольхи черной и серой. Опыт представляет интерес по изучению возможности использования последних как посадочный материал для лесосеменных плантаций и лесных культур. В опыте представлены регенеранты 2 типов культуры: культура стеблевых узлов с 1 почкой и каллусная культура. В условиях теплицы регенеранты доращивались до возраста 1 и 2 лет. В условия опыта регенеранты высажены весной 2002 года. При сравнении роста регенерантов в опыте с закрытой и открытой корневой системой достоверно лучший рост отмечен в первом случае (tф=2,75>tст.=2,04). Регенеранты, высаженные в возрасте 1 год, догнали по росту в высоту 2-летние. В 3 года отмечался вторичный рост по всем вариантам опыта и ухудшение общего состояния. Культуры из сеянцев превосходили регенеранты на 0,2 – 0,6 м.
В 2010 году проведено обследование плантации ольхи черной и серой, созданной сеянцами и регенерантами in vitro.
Анализ роста клонов и сеянцев показал, что различия между регенерантами и сеянцами были не существенными на 5 % уровне значимости. Средняя высота регенерантов составила 4,9±0,37 – 5,6±0,69 м., средний диаметр 4,7±0,76 – 5,3±0,73 см. Средняя высота сеянцев 4,9±0,35 м, средний диаметр 5,2±0,68 – 5,4±0,81 см. Уровень изменчивости по высоте у регенерантов был средним – 19 %, повышенным – 25 – 27 % и высоким 32 %. Уровень изменчивости по диаметру был очень высоким.
Генеративное развитие деревьев ольхи семенного происхождения и регенерантов in vitro различается. Ольха черная начинает цвести и плодоносить в культурах с 3–6 лет, значительной семенной продуктивности она достигает лишь в 15–20 летнем возрасте [1, 2 и др.]. При микроклональном размножении деревьев ольхи черной они начинают цветение уже на 3–4 год. Нами приводятся сравнительные данные генеративного развития клонированных растений и сеянцев ольхи. Основные лесообразующие породы, в том числе ольха относятся к перекрестно опыляемым растениям, хотя некоторые биотипы дают качественные семена и при самоопылении [1, 4]. Известно, что урожай и качество семян у древесных пород определяются условиями опыления, то есть количеством, составом и качеством пыльцы в период цветения. Мужские цветки собраны в соцветия – густоцветковые сережки. Рано весной (когда тает снег), сережки вытягиваются, и пыльца высыпается.
Известно несколько методов определения жизнеспособности пыльцы в лабораторных условиях [4, 8 и др.]: проращивание пыльцы на жидких средах, твердых средах и экспресс-методы (реакция красителей на жизненно важные ферменты и другие вещества пыльцы). Нами использовался быстрый метод окрашивания пыльцы йод-хлоралгидратом, обычно жизнеспособные пыльцевые зерна полностью заполнены крахмалом. Если пыльцевые зерна полностью окрашиваются реактивом в виде фиолетовых зерен, то пыльца считается жизнеспособной. Половину частично окрашенных зерен относят к жизнеспособным, остальные к нежизнеспособным (рисунок 1). Определение жизнеспособности свежесобранной пыльцы проведено сразу после сбора методом окрашивания йод-хлоралгидратом (таблица 1).
Таблица 1. Жизнеспособность пыльцы регенерантов и сеянцев ольхи черной и серой
|
Название дерева |
Количество окрашенных пыльцевых зерен, % |
|
|
3.04.2011 г. |
25.05.2011 г. |
|
|
Ольха черная № 46 (сеянцы) |
98 |
79 |
|
Ольха черная № 46 (in vitro) |
97 |
74 |
|
Ольха черная № 3 (in vitro) |
98 |
81 |
|
Ольха серая № 6 (сеянцы) |
95 |
83 |
|
Ольха серая № 6 (in vitro) |
96 |
87 |
При определении жизнеспособности пыльцы экспресс-методом установлено, что жизнеспособность пыльцы сеянцев ольхи черной и серой не отличается от микроклонированных растений. Жизнеспособность пыльцы ухудшается через два месяца на 15 – 20 %, то есть пыльцу можно хранить до двух месяцев. Хранение пыльцы проведено в пробирках в сухом прохладном, темном месте (на дне холодильника).
а)
б)
в)
г)
Рисунок 1. Пыльцевые зерна ольхи: а) ольха черная сеянцы; б) ольха черная, регенеранты in vitro; в) ольха серая, сеянцы; г) ольха серая, регенеранты in vitro
Качественный и количественный состав формирующейся пыльцы в значительной степени определяется динамикой и характером поведения хромосом в мейозе при микроспорогенезе. Известно также, что между размерами пыльцевых зерен и плоидностью существует прямая зависимость. Исходя из этого, по такому морфометрическому показателю, как диаметр пыльцы, можно опосредованно судить об особенностях развития мужского гаметофита исследуемых организмов, об их генетической природе, в частности, о возможной гибридной, мутагенной или полиплоидной природе. Этот показатель важен для перекрестного опыления на лесосеменных плантациях.
Морфометрические показатели качественного состава пыльцы представлены в таблице 2.
Таблица 2. Диаметр пыльцевых зерен у исследуемых деревьев ольхи черной и серой
|
№ дерева |
Диаметр пыльцы (мкмм), количество пыльцевых зерен, % |
|||
|
21,7-24,8 |
27,9-31,0
|
< 31,0
|
деформи-рованная пыльца |
|
|
Ольха черная № 46, сеянец |
56 |
41 |
- |
3 |
|
Ольха черная, регенерант от № 46 |
16 |
60 |
22 |
2 |
|
Ольха черная, регенерант от № 3 |
15 |
61 |
23 |
1 |
|
Ольха серая № 6, сеянец |
48 |
52 |
- |
- |
|
Ольха серая, регенерант от № 6 |
8 |
36 |
52 |
4 |
Анализ завершающего этапа формирования микроспор показал, что у регенерантов и сеянцев ольхи черной и серой процесс развития мужской генеративной сферы протекает без значительных отклонений и заканчивается образованием качественной, выравненной пыльцы. У регенеранта ольхи черной № 46 и черной № 3 наряду с нормальными выявлены и аномальные пыльцевые зерна, вероятно, гиперанеуплоиды с повышенным числом хромосом микроспоры. Обнаруженные мелкие пыльцевые зерна являются, вероятно, гипоанеуплоидными. Полученные данные на пяти деревьях свидетельствуют о том, что пыльца регенерантов ольхи черной достоверно (на 5 % уровне значимости) крупнее, чем у сеянцев, и соответственно равны 28,3 ± 0,41 и 25,5 ± 0,48. Различия размеров пыльцы регенерантов in vitro и сеянцев существенны на 5 % уровне (tфакт. = 5,57 > t0.05 = 2,06).
Характеристика количественных показателей у шишек показала, что по коэффициенту формы шишек различия у них были не существенными (рисунок 2).
Рисунок 2. Обильное плодоношение регенерантов ольхи черной
Коэффициент формы шишек (отношение ширины к длине шишек) составил в среднем 0,50 – 0,64. Длина шишек у сеянцев составила в среднем от 1,6±0,03 до 1,8±0,06 см, у регенерантов – от 1,4±0,04 до 1,7±0,04 см. Различия по длине шишек достоверны на 95 % уровне значимости. Ширина шишек у сеянцев составила 0,9±0,03, у регенерантов от 0,8±0,04 до 0,9±0,02 см. Различия по ширине шишек у сеянцев и регенерантов отсутствуют. Лабораторная всхожесть семян, полученных от регенерантов и сеянцев, не отличается и составляет 85 %.
Заключение
Таким образом, первые опыты использования регенерантов in vitro ольхи для создания клоновых лесосеменных плантаций и культур этой породы представляют огромный интерес в селекционно-семеноводческой и лесокультурной практике. Изучение качественных и количественных характеристик пыльцы, шишечек и семян деревьев-регенерантов показало перспективность микроклонального метода при создании клоновых лесосеменных плантаций.
Рецензенты:
Панков Я. В., д.с.-х.н., профессор кафедры лесных культур, селекции и лесомелиорации ФГБОУ ВПО "Воронежская государственная лесотехническая академия", г. Воронеж.
Ефимов Ю. П., д.с.-х.н., профессор, главный научный сотрудник ФГУПНШ лесной генетики и селекции, г. Воронеж.