Наиболее вероятным механизмом релаксирующего действия H2S считают увеличение выходящего калиевого тока, в основном, за счет активации АТФ-чувствительных калиевых каналов (К+АТФ-каналов) [4,7]. Вовлечение в данный процесс других типов калиевых каналов, таких как потенциал-зависимые (K+v-каналы) и кальций-чувствительные (K+Ca2+-каналы) калиевые каналы, долгое время отрицалось [9]. Несмотря на это, все чаще встречаются сообщения об активирующем влиянии сероводорода на K+Ca2+-каналы высокой проводимости, либо K+v-каналы, которые, предположительно, могут играть не менее значимую роль в реализации релаксирующего действия H2S [2,3]. Таким образом, к настоящему времени окончательного решения по вопросу механизмов действия сероводорода не найдено.
Цель исследования. Изучить роль калиевых каналов в опосредовании релаксирующего действия сероводорода.
Материалы и методы. Объектом исследования служили деэндотелизированные гладкомышечные сегменты грудного отдела аорты беспородных белых крыс весом 180-250 гр. После выделения аорту помещали в физиологически сбалансированный солевой раствор Кребса, отпрепаровывали жировую и соединительную ткань и выделяли сегменты шириной 2-3 мм. Эндотелий удаляли механически, вращением деревянного шпателя в просвете сегмента в течение 1 минуты непосредственно перед выполнением эксперимента.
Исследование сократительной активности гладкомышечных препаратов проводили с использованием сертифицированной четырехканальной механографической установки Myobath II и аппаратно-программного комплекса LAB-TRAX-4/16. Гладкомышечные сегменты фиксировали с помощью стальных крючков в термостатируемой камере объемом 10 мл и предварительно растягивали нагрузкой 500 мг.
Амплитуду контрольных (100 %) сократительных ответов сосудистых сегментов на действие гиперкалиевого раствора (замена 30 мM NaCl на KCl) или фенилэфрина (10 мкМ) регистрировали после 40-50 минут выдерживания в нормальном растворе Кребса.
Физиологический раствор Кребса содержал (мM): 120.4 NaCl, 5.9 KCl, 2.5 CaCl2, 1.2 MgCl2, 5.5 глюкозы, 15 C4H11O3N [tris(oxymethyl)-aminometan] (pH 7.4; 316.4 мосМ). В качестве донора сероводорода использовали гидросульфид натрия (NaHS).
Используемые реактивы: 4-аминопиридин (Sigma); гидросульфид натрия (Sigma); глибенкламид (Sigma); тетраэтиламмония хлорид (Serva); фенилэфрин (Sigma); харибдотоксин (Sigma).
Статистическая обработка. Анализ данных проводили при помощи программы Statistica 7.0 for Windows фирмы Statsoft. Фактические данные представлены в виде «среднее ± ошибка среднего» (X±m). Сформированные выборки не подчинялись закону нормального распределения, поэтому для проверки статистических гипотез были использованы U-критерий Манна - Уитни (Mann-Whitney U test) и Т-критерий Уилкоксона (Wilcoxon mached pairs test).
Результаты и обсуждение
Исследование роли калиевой проводимости мембраны в опосредовании вазорелаксирующего действия сероводорода при гиперкалиевом сокращении
Эквимолярное замещение в растворе Кребса 30мМ NaCl на KCl приводило к развитию поддерживаемого сократительного ответа, величина которого принималась за 100 %.
Неизбирательный блокатор калиевых каналов тетраэтиламмоний (ТЭА) в концентрации 10мМ увеличивал механическое напряжение (МН) гладкомышечных сегментов аорты крысы, предсокращенных гиперкалиевым раствором до 109.1±1.0% (n=4, p<0.05). В присутствии ТЭА величина констрикторного действия 5, 10, 50 и 100 мкМ NaHS снижалась, составив 103.8±0.9 %, 104.9±1.7 %, 108.5±2.5 % и 116.7±3.7 % (n=6, p<0.05) соответственно. NaHS в концентрации 500 мкМ вызывал сокращение гладкомышечного сегмента до 106.4±7.8 % (n=6, p<0.05), а релаксирующее влияние 1000 мкМ NaHS ослаблялось: МН составило только 95.4±7.1 % (n=6, p<0.05) от амплитуды гиперкалиевого предсокращения в присутствии ТЭА (рис.1А).
Блокатор К+АТФ-каналов глибенкламид (10мкМ) снижал величину МН гладкомышечных препаратов, предсокращенных гиперкалиевым раствором до 95,5±1,6 % (n=6, p<0.05) от контрольного гиперкалиевого сокращения. На этом фоне констрикторное действие 5, 10, 50 и 100 мкМ NaHS обращалось на релаксирующее, при этом величина МН составила 95.3±2.4 %, 93.1±3.6 %, 90.1±4.4 % и 76.6±10.5 % (n=6, p<0.05) соответственно от величины гиперкалиевого сокращения в присутствии глибенкламида; величина релаксирующего эффекта 500 и 1000 мкМ NaHS достоверно не изменялась (рис.1Б).
Блокатор К+v-каналов 4-аминопиридин (1мМ) увеличивал амплитуду сократительного ответа до 127.9±5.5 % (n=4, p<0.05) от контрольного гиперкалиевого предсокращения. При этом наблюдалось снижение как величины констрикторного действия 10, 50 и 100 мкМ NaHS (107.7±1.7 %, 107.9±4.2 % и 106.8±7.4 % (n=4, p<0.05) соответственно), так и величины релаксирующего действия 500 и 1000 мкМ NaHS (80.4±5.3 % и 76.5±1.2 % (n=4, p<0.05) соответственно, от гиперкалиевого сокращения в присутствии 4-аминопиридина) (рис.1В).
А  |
Б |
В  |
Г  |
|
Рис. 1. Влияние тетраэтиламмония (А), глибенкламида (Б), 4-аминопиридина (В) и харибдотоксина (Г) на эффекты гидросульфида натрия в гладкомышечных клетках аорты крысы, предсокращенных гипрекалиевым (30мМ KCl) раствором
* - отмечены достоверные отличия механического напряжения после добавления гидросульфида натрия от гиперкалиевого сокращения в присутствии блокатора (p<0.05). |
|
- гиперкалиевое сокращение; 
- гиперкалиевое сокращение в присутствии блокатора калиевых каналов. По оси ординат - механическое напряжение (%). По оси абсцисс - десятичный логарифм концентрации гидросульфида натрия.
Блокатор К+Са2+-каналов харибдотоксин (0.1 мкМ) не изменял величину гиперкалиевого предсокращения, но устранял констрикторное действие 5, 10, 50 и 100 мкМ
NaHS (МН составило 99.5±4.0 %, 99.3±3.5 %, 102.8±1.6 % и 102.9±0.2 % (n=3, p<0.05) соответственно, от гиперкалиевого сокращения в присутствии харибдотоксина). Релаксирующее действие 500 и 1000 мкМ NaHS усиливалось (МН составило 15.6±7.5 % и 14.1±6.3 % (n=3, p<0.05) соответственно, от гиперкалиевого сокращения в присутствии харибдотоксина) (рис.1Г).
Исследование роли калиевой проводимости мембраны в опосредовании вазорелаксирующего действия сероводорода при сокращении, индуцированном фенилэфрином.
Добавление в омывающий раствор Кребса α1 - адреномиметика фенилэфрина (ФЭ, 10мкМ) вызывало сократительный ответ по амплитуде сравнимый с гиперкалиевым.
Инкубация с ТЭА приводила к увеличению МН гладкомышечных сегментов, предсокращенных 10 мМ ФЭ, до 130.1±12.6 % (n=6, p<0.05). На этом фоне NaHS (5, 10, 50 мкМ) вызывал увеличение МН гладкомышечных сегментов до 111.98±5.3 %, 109.4±4.7 % и 113.7±9.0 % (n=9, p<0.05) соответственно, а расслабляющее действие 100, 500 и 1000 мкМ NaHS уменьшалось, величина МН составила только 77.6±9.7 %, 61.6±6.2 % и 54.9±3.6 % (n=9, p<0.05) соответственно, от ФЭ-индуцированного предсокращения в присутствии ТЭА (рис.1А).
Блокатор К+АТФ-каналов глибенкламид (10 мкМ) снижал величину предсокращения фенилэфрином до 87.6±4.0 % (n=8, p<0.05) от контрольного ФЭ-индуцированного сокращения. NaHS в концентрациях 10 и 100 мкМ не изменял величину сократительного ответа. При действии 50 мкМ NaHS наблюдалось увлечение МН сосудистых сегментов до 113.6±10.8 % (n=8, p<0.05), а эффективность расслабляющего действия 500 и 1000 мкМ NaHS достоверно снижалась: МН составило 81.5±12.2 % и 53.1±12.6 % (n=8, p<0.05) соответственно, от величины ФЭ-индуцированного сокращения в присутствии глибенкламида (рис.2Б).
Блокатор K+v-каналов 4-аминопиридин (1мМ) увеличивал МН до 127.9±5.5 % (n=7, p<0.05) от контрольного ФЭ-индуцированного сокращения. В этих условиях расслабляющее действие 5, 10 и 50 мкМ NaHS усиливалось (МН составило 74.5±3.4 %, 66.9±2.8 %, 57.7±2.2 %, (n=7, p<0.05) соответственно), а релаксирующий эффект 100, 500 и 1000 мкМ NaHS достоверно снижался (МН составило 66.4±5.6 %, 64.1±3.8 %, 51.5±9.0 %, (n=7, p<0.05), соответственно от контрольного ФЭ-индуцированного предсокращения в присутствии 4-аминопиридина) (рис.2В).
Блокатор К+Са2+-каналов харибдотоксин (0.1 мкМ) увеличивал МН до 113.3±10.9 % (n=3). На этом фоне величина релаксирующего действия 5, 10 мкМ NaHS достоверно увеличивалась (МН составило 58.8±4.0 %, 50.4±7.3 % (n=3, p<0.05) соответственно, от величины ФЭ-индуцированного сокращения в присутствии харибдотоксина). Величина релаксирующего действия 50, 100, 500, 1000 мкМ NaHS статистически значимо не изменялась (рис.2Г).
|
А |
Б |
|
В |
Г |
|
Рис. 2. Влияние тетраэтиламмония (А), глибенкламида (Б), 4-аминопиридина (В) и харибдотоксина (Г) на эффекты гидросульфида натрия в гладкомышечных клетках аорты крысы, предсокращенных раствором фенилэфрина (10мкМ) - фенилэфрин-индуцированное сокращение; - фенилэфрин-индуцированное сокращение в присутствии блокатора калиевых каналов. По оси ординат - механическое напряжение (%). По оси абсцисс - десятичный логарифм концентрации гидросульфида натрия. * - отмечены достоверные отличия механического напряжения после добавления гидросульфида натрия от фенилэфрин-индуцированного сокращения в присутствии блокатора (p<0.05). |
|
Основным механизмом реализации релаксирующего действия H2S является активация калиевой проводимости мембраны. Так, неселективный блокатор калиевых каналов ТЭА ингибировал релаксирующее действие NaHS как при гиперкалиевом, так и при ФЭ-индуцированном сокращении. Традиционно главной мишенью для сероводорода считаются К+АТФ-каналы [4]. Однако эксперименты, проведенные с селективными блокаторами основных типов калиевых каналов, таких как K+Ca2+-каналы, К+v-каналы и К+АТФ-каналы, показали, что основную роль в данном процессе играют потенциал-зависимые калиевые каналы. Полученные результаты согласуются с данными некоторых авторов [2,3]. Значимость этих каналов для H2S-опосредованной релаксации ГМК подтверждена для сократительных реакций, индуцированных как активацией α1-адренерецерторов, так и деполяризацией мембраны гиперкалиевым раствором. Вовлечение в релаксирующее действие сероводорода К+АТФ-каналов выявлено только для сокращений, индуцированных ФЭ.
Блокирование К+Са2+-каналов высокой проводимости харибдотоксином усиливало релаксирующее действие NaHS при деполяризации мембраны ГМК гиперкалиевым раствором, но не оказывало значимого влияния при активации α1-адренорецепторов. Учитывая тот факт, что активация С-киназной ветви кальциевой сигнальной системы посредством α1-адренорецепторов индуцирует высвобождение Са2+ из внутриклеточных депо, и роль этого механизма при деполяризации мембраны гиперкалиевым раствором выражена в меньшей степени, то можно предположить, что H2S - индуктор увеличения внутриклеточной концентрации ионов Са2+ за счет высвобождения его из внутриклеточного депо, может быть причиной дополнительной активации К+Са2+ -каналов. Это, в свою очередь, может обуславливать парадоксальную реакцию усиления релаксирующего действия H2S при блокировании К+-тока.
Таким образом, релаксирующее действие сероводорода при деполяризации мембраны гиперкалиевым раствором обусловлено преимущественно потенциал-зависимыми калиевыми каналами, тогда как релаксирующее действие сероводорода при фенилэфрин-индуцированном сокращении опосредовано потенциал-зависимыми и АТФ-чувствительными калиевыми каналами.
Исследование выполнено в рамках реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. (ГК№14.740.11.0932) и регионального конкурса РФФИ р_сибирь_а (ГК№11-04-98073).
Рецензенты:
- Ласукова Татьяна Викторовна, доктор биологических наук, профессор кафедры медико-биологических дисциплин ГБОУ ВПО Томский государственный педагогический университет Министерства образования и науки Российской Федерации, г. Томск.
- Капилевич Леонид Владимирович, доктор медицинских наук, заведующий кафедрой спортивно-оздоровительного туризма, спортивной физиологии и медицины, ФГБОУ ВПО «Национальный исследовательский Томский государственный университет», г. Томск.