Риск развития первично-множественных злокачественных новообразований толстой кишки составляет 6% от всех злокачественных новообразований толстой кишки, при этом риск синхронных, как и метахронных составляет по 3% [8].
Доказано, что одной из причин развития злокачественных новообразований является недостаточность иммунной защиты организма, особенно ее Т-клеточного звена. Последняя осуществляет контроль за соматическими клетками, результатом чего является элиминация любых клеток, несущих чужеродную генетическую информацию [9].
Иммунная система толстой кишки представлена организованной лимфоидной тканью, расположенной вдоль поверхности кишки (в собственной пластинке), которая включает изолированные и сгруппированные лимфоидные фолликулы, лимфоидную ткань червеобразного отростка, мезентериальные (брыжеечные) лимфатические узлы. В лимфоидных фолликулах слизистой оболочки толстой кишки содержатся главным образом В-лимфоциты, с некоторым количеством Т-лимфоцитов-хелперов (CD4+) и цитотоксических лимфоцитов (CD8+). В собственной пластике слизистой оболочки толстой кишки, помимо плазматических клеток и Т-лимфоцитов, содержатся тканевые базофилы, макрофаги, В-лимфоциты, NК-клетки, эозинофилы и нейтрофилы [4; 6].
Наиболее активными участниками противоопухолевого иммунитета являются два типа клеток: Т- и NК- лимфоциты [2].
При изучении дифференцировки иммунокомпетентных клеток и механизмов межклеточного взаимодействия, формирующих клеточный и гуморальный иммунитет, была открыта большая группа медиаторов белковой природы, названных цитокинами. Их продукция рассматривается в качестве важнейшей характеристики функциональной активности мононуклеарных клеток (лимфоцитов и моноцитов) [6]. Важное место в осуществлении межклеточных взаимодействий и реализации противоопухолевого ответа иммунной системы принадлежит цитокиновой регуляции, в частности IL-2, IL-4, IL-12, IL-15, IL-23, IFN-g и др. [1].
По основным механизмам действия цитокины подразделяются на ростовые (колониестимулирующие) факторы, контролирующие продукцию иммунокомпетентных клеток; провоспалительные (IL-1, 6, 8, 12, 18, TNF-α и др.), обеспечивающие мобилизацию и активацию клеток - участников воспаления; противовоспалительные цитокины (IL-2, 4 и др.) с альтернативным характером действия, ограничивающие развитие воспаления, регулирующие клеточный и гуморальный иммунитет [6]. Цитокины также регулируют процессы ангиогенеза, регенерации, пролиферации, апоптоза, метаболические процессы и т.д. [1; 6]. Основными продуцентами провоспалительных цитокинов являются активированные моноциты, макрофаги, ДК, NK, а также Т- и В-лимфоциты; противовоспалительных - Т-клетки, преимущественно CD3+CD4+CD8- (Th1 и Th2).
В настоящее время известно, что многие цитокины (IL-1α, IL-6, IL-8, IL-10, ТNF-α., IL-23, IL-24) могут вырабатываться не только лимфоцитами, но и опухолевыми клетками, следовательно, способны проявлять себя как факторы усиления опухолевой прогрессии, активирующие ангиогинез и миграцию опухолевых клеток. ТNF-α, являясь индуктором апоптоза и неоангиогенеза, может вызывать усиление гибели, например, лимфоцитов, находящихся на данной территории, и распространение туда опухолевых клеток [1].
Исходя из вышеперечисленного можно сделать вывод, что содержание субпопуляций лимфоцитов и уровень цитокинов в периферической крови и тканях играет важную роль в процессах канцеропрогрессии.
Цель исследования. Изучить содержание субпопуляций лимфоцитов в периферической крови и тканях толстой кишки, а также уровень цитокинов в тканях толстой кишки при одиночном и первично-множественном синхронном раке толстой кишки (РТК).
Материалы и методы
Для изучения уровня субпопуляции лимфоцитов и цитокинов нами было проведено исследование периферической крови и ткани кишки у 46 больных одиночным раком толстой кишки и 17 больных первично-множественным синхронным раком толстой кишки (1-4 стадии).
Для изучения субпопуляции лимфоцитов периферической крови бралась кровь из локтевой вены натощак утром, в качестве антикоагулянта использовался гепарин. Для изучения внутритканевого уровня субпопуляций лимфоцитов были исследованы участки ткани кишки у 46 больных одиночным раком толстой кишки и 17 больных первично-множественным синхронным раком толстой кишки (1-4 стадии).
В ходе оперативных вмешательств проводилось удаление опухолевого очага с последующим исследованием ткани опухоли, а также визуально неизмененных участков кишки, отступя 1-3 см (перифокальная зона) и 10 см (линия резекции) от края опухоли. Последнюю считали нормой. Полученные образцы ex temporaе помещали в среду 199 для исследования в лаборатории проточной цитометрии. Аналогичные участки, взятые в формалине, направляли в патоморфологическую лабораторию РНИОИ для верификации диагноза.
Локальный уровень субпопуляций лимфоцитов, выделенных из образцов ткани кишки и периферической крови, определяли иммунофенотипированием на проточном цитометре BDFACSCantoll (USA). Результаты выражали в %.
Локальный уровень провоспалительных (TNF-α, IL-6, IL-8, IL-1RA) и противовоспалительных цитокинов (IL-2, IL-10) в гомогенатах образцов ткани кишки определяли иммуноферментным методом. Образцы ткани отмывали в среде для удаления клеток крови, размельчали и гомогенизировали в растворе Версена на магнитной мешалке в течение 15 минут при температуре 22 °С, фильтровали через капроновый фильтр. Гомогенат стерильно отбирали и хранили при -20 °С в течение 1 месяца до иммуноферментного исследования, которое проводили с помощью наборов фирмы «Вектор-Бест». Результаты выражали в пг/мл. Кроме того, в гомогенате определяли биуретовым методом количество белка и удельное содержание цитокинов в расчете на один грамм белка.
Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием статистических пакетов Statistica 6.0 и Microsoft Excel 2007.
Результаты исследования
Субпопуляционный состав лимфоцитов крови и исследованных образцов тканей больных одиночным и первично-множественным РТК представлен в таблицах 1 и 2.
Таблица 1 - Субпопуляции лимфоцитов периферической крови больных одиночным и синхронным раком толстой кишки
|
Пробы крови |
Субпопуляции лимфоцитов, % |
||||
|
CD3+ |
CD3+CD4+ |
CD3+CD8+ |
CD19+ |
CD16+/56+ |
|
|
Одиночный (n=46) |
73,5±2,28 |
42,3±3,08 |
30,2±3,0 |
10,43±1,3 |
14,96±1,92 |
|
Сихронный (n=17) |
69,1±0,72* |
42,2±2,4 |
26,36±2,24 |
12,4±2,0 |
17,1±1,6 |
* - статистически достоверные различия (Р<0,05).
Как видно из таблицы 1, различия между двумя группами больных были незначительны, только лишь при одиночном раке уровень Т-лимфоцитов (CD3+) статистически достоверно был выше, чем при синхронном раке толстой кишки. По другим исследуемым субпопуляциям лимфоцитов статистически значимых отличий не обнаружено.
В отличие от иммунологических данных, характеризующих периферическую кровь, изучение локальных факторов клеточного иммунитета показало более выраженные изменения в группах больных с одиночными и синхронными раками толстой кишки (табл. 2).
Таблица 2 - Субпопуляции лимфоцитов тканей больных одиночным и синхронным раком толстой кишки
|
РТК |
Образцы тканей |
Субпопуляции лимфоцитов, % |
||||
|
CD3+ |
CD3+CD4+ |
CD3+CD8+ |
CD19+ |
CD16/56 |
||
|
Одиночный (n=46) |
Опухоль |
61,2±4,5■ |
33,0±3,0● |
26,9±4,5 |
24,1±5,2■ |
12,4±3,5 |
|
Перифокальная зона |
47,6±5,1 |
21,4±3,8 |
21,0±5,1 |
43,64±7,6 |
10,8±3,0 |
|
|
Линия резекции |
49,0±7,5 *** |
21,4±4,1 |
26,5±6,6 *** |
35,8±5,3 |
13,9±4,9 |
|
|
Синхронный (n=17) |
Опухоль |
68,3±4,77■ |
33,5±3,23●■ |
32,1±4,7● |
22,0±4,39■ |
5,2±1,96 |
|
Перифокальная зона |
48,6±5,09● |
18,2±2,99 |
29,2±4,11● |
37,4±4,3 |
11,18±5,0 |
|
|
Линия резекции |
64,2±5,87■ |
16,3±2,65 |
47,0±5,75■* |
25,8±5,06 |
9,0±4,5 |
|
● - статистически достоверные отличия от линии резекции (Р<0,05);
■ - статистически достоверные отличия от перифокальной зоны (Р<0,05);
* - от одиночного РТК;
*** - от синхронного РТК.
Как видно из таблицы 2, в образцах одиночных и синхронных опухолей отмечается накопление Т-лимфоцитов (CD3+), в частности с фенотипом СD3+СD4+, содержание которых в опухоли статистически значимо было выше, чем в немалигнизированной ткани по линии резекции на 54% и в 2 раза соответственно, а количество В-лимфоцитов было ниже на 45 и 41% соответственно (Р<0,05). При этом уровень СD3+СD8+ клеток в ткани синхронных опухолей и их перифокальных зон оказался статистически достоверно ниже, чем по линии резекции на 32 и 38% соответственно.
При исследовании ткани толстой кишки по линии резекции обнаружено, что при одиночных опухолях она содержит меньше на 44% ЦТЛ (CD3+СD8+), чем при синхронных. Состав других изученных субпопуляций лимфоцитов в перифокальных зонах по большинству показателей не выявил статистически значимых различий.
Удельное содержание цитокинов в образцах тканей толстой кишки у больных одиночным и первично-множественным синхронным раком толстой кишки представлено в таблице 3.
Таблица 3 - Уровни цитокинов в образцах тканей больных одиночным и синхронным раком толстой кишки
|
Образцы тканей |
Исследуемый материал |
Удельное содержание цитокинов (пг/мл белка) |
|||||||
|
IL-2 |
TNF-α |
IL-6 |
IL-8 |
IL-10 |
IL-1α |
IL-1ß |
IL-1RА |
||
|
РТК одиночный(n=46) |
Опухоль |
3,29± 1,45 |
1,89± 0,43 |
14,24± 1,63 ● |
33,0± 2,37●■ |
1,52± 0,4 |
49,68± 11,4●■ *** |
14,88± 5,11● |
343± 25 *** ●■ |
|
Перифокальная зона |
0,91± 0,146 |
0,64± 0,07*** |
4,9± 1,23 |
17,27± 2,27 |
0,7± 0,13 *** |
17,7± 6,11 |
4,85± 2,1 |
220± 16,4 |
|
|
Линия резекции |
1,78± 0,53 |
1,04± 0,29 |
5,22± 1,09 |
13,0± 1,63 |
1,23± 0,36 |
18,8± 5,52
|
2,79± 1,53 |
234,2± 15,8 |
|
|
РТК синхронный(n=17) |
Опухоль |
1,75± 0,25 |
2,35± 0,41 ● |
12,85± 1,73●■ |
29,97± 2,73●■ |
2,02± 0,47 |
18,0± 4,68* |
15,65± 2,8●■ |
263± 17,3* ●■ |
|
Перифокальная зона |
1,13± 0,21 |
1,34± 0,33* |
5,91± 1,01 |
14,9± 2,0 |
1,48± 0,36* |
20,14± 4,82 |
2,52± 0,31● |
210,7± 11,2 |
|
|
Линия резекции |
1,02± 0,29 |
0,95± 0,27* |
3,98± 0,86 |
12,7± 2,25 |
0,97± 0,24 |
12,5± 3,91 * |
1,28± 0,34■ |
209,4± 17,3 |
|
Статистически достоверные отличия (Р<0,05):
* - от одиночного РТК;
*** - от синхронного РТК;
● - от линии резекции;
■ - от перифокальной зоны.
Сравнение удельного уровня цитокинов в исследуемых образцах одиночных и первично-множественных опухолей показало, что у больных с одиночным РТК содержание большинства из них было выше в опухоли, чем в немалигнизированной ткани. Такие различия статистически достоверны для IL-6, IL-8, IL-1 и IL-1RА. Образцы ткани синхронных опухолей также содержат статистически достоверно более высокие количества цитокинов, чем перифокальная зона (IL-6, IL-8, IL-1ß и IL-1RА) и ткань по линии резекции (TNF-α, IL-6, IL-8, IL-1ß и IL-1RА).
Результаты сопоставления уровня цитокинов в опухолевой ткани показали, что в синхронных опухолях определяется более низкий уровень IL-1α и его антагониста, чем в одиночных.
В ткани перифокальной зоны синхронных опухолей уровни TNF-α и IL-10 были в 2 раза выше, чем в соответствующих образцах одиночных опухолей.
Результаты определения в образцах тканей уровней IL-2 и IL-10 показали отсутствие статистически значимых различий во всех исследованных пробах.
Заключение
Учитывая то, что наблюдалось снижение интратуморального количества CD19+-лимфоцитов и накопление Т-лимфоцитов (CD3+), а также что наибольший уровень обнаруженных провоспалительных (TNF-α, IL-6, IL-8, IL-1RA) и противовоспалительных цитокинов (IL-2, IL-10) был в тканях опухоли, можно предположить, что на фоне злокачественного процесса в толстой кишке происходят нарушения локального клеточного иммунитета, связанные с дисбалансом субпопуляций лимфоцитов. Кроме того, по показателям цитокинов можно предположить способность опухолевых клеток к аутокринной продукции провоспалительных цитокинов. Найденные изменения свидетельствуют о важной роли тканевых иммунно-воспалительных реакций в патогенезе одиночного и первично-множественного синхронного рака толстой кишки.
Рецензенты
- Каймакчи О.Ю., д.м.н., ассистент кафедры онкологии Ростовского государственного медицинского университета, г. Ростов-на-Дону.
- Николаева Н.В., д.м.н., ассистент кафедры онкологии Ростовского государственного медицинского университета, г. Ростов-на-Дону.