Определение в биожидкостях веществ, концентрация которых ниже порога определения современных приборов, является достаточно сложной задачей. Современная практика предлагает в данном случае несколько решений. В западных странах часто используют ферментативный гидролиз конъюгатов с последующим проведением твердофазной экстракции. В России эти методы не имеют широкого распространения в связи с высокой стоимостью расходных материалов.
Другим возможным вариантом повышения чувствительности при анализе сильно разбавленных растворов является увеличение объема пробы, взятой для жидкость-жидкостной экстракции. В данном случае возникает проблема большого количества балластных веществ, экстрагируемых в слой органического растворителя, что приводит к значительным сложностям в ходе качественного и количественного определения. Метод выпаривания позволяет проводить концентрирование, но в данном случае возникает риск улетучивания, разрушения веществ в процессе нагревания. Метод вакуумной отгонки требует специализированного оборудования, занимает длительное время, и также существует риск улетучивания искомых веществ с парами воды.
В предыдущих экспериментах нами была разработана и изучена методика холодового концентрирования разбавленных водных растворов неорганических и органических веществ, мочи здорового человека, модельных образцов мочи, а также реальных образцов мочи, содержащих различные токсикологически значимые вещества [1].
Суть метода холодового концентрирования заключается в контролируемом частичном замораживании части жидкости, так что растворенные вещества концентрируются в жидкой фазе. Оптимальной температурой морозильной камеры является -12 °C, материал сосудов - стекло, соотношение высоты/диаметра сосуда порядка 1.
При изучении холодового концентрирования образцов мочи было установлено, что высокомолекулярные липофильные вещества, содержащиеся в моче наркоманов в большом количестве, обычно в значительной степени попадают в твердую, ледяную фракцию. Это вызвано тем, что уже при охлаждении мочи до 0 °C липидоподобные вещества, растворенные в моче, превращаются в эмульсию. На границе лед/вода воскоподобные частицы переохлажденной эмульсии легко включается в структуру растущего льда. Благодаря тому что моча является раствором многих веществ, растущие кристаллы льда являются мелкими и обычно неправильной формы, а значит площадь поверхности соприкосновения лед/вода достаточно велика.
Именно фактор большой площади контакта фаз является основной причиной включения липидоподобных веществ в структуру льда. Таким образом, в рекомендованном диапазоне температур (-11 - -15 °C) происходит значительная очистка пробы от липидоподобных веществ без существенной потери аналитов [2].
Цель исследования
На основе приведенных выше преимуществ методики холодового концентрирования разработать методику определения метилендиоксиметамфетамина в пробах, забор которых производился после окончания периода полувыведения вещества, когда имеющиеся широко распространенные методы не позволяют надежно установить факт употребления MDMA.
Экспериментальная часть
Реагенты. Две пробы мочи были взяты у лица, предположительно употребившего MDMA. Образец 1 был взят через 8 часов после употребления, образец 2 - через 56 часов.
Раствор для гидролиза конъюгатов содержал хлороводородную кислоту. Для осаждения балластных веществ использовали раствор трихлоруксусной кислоты.
Экстракция из биоматериала проводилась в слой хлороформа.
Методы. Определение проводилось посредством газо-жидкостной хроматографии с масс-селективным детектированием.
Инструментарий. Газо-жидкостный хроматограф с масс-селективным детектором Agilent 7890/5975с. Температура инжектора - 170 °C, температура интерфейса - 220 °C. Температура колонки программированно изменялась от 70 °C - 1,5 мин, с последующим увеличением температуры со скоростью 5 °C/мин до 230 °C. Колонка HP 5 MS (30 м×0,25 мм толщина неподвижной фазы 0,25 мкм). Газ-носитель: гелий.
Проведение анализа. В серии из трех опытов 20 мл пробы 1 помещали в стеклянный стакан, рН доводили до 2 раствором хлороводородной кислоты, после чего пробу выдерживали на водяной бане 30 минут. После охлаждения смеси к ней добавляли 3 мл раствора трихлоруксусной кислоты для осаждения балластных веществ. Затем проводили трехкратную экстракцию в слой хлороформа. Экстракт упаривали, сухой остаток растворяли в 0,5 мл хлороформа. Концентрат исследовали с помощью ГХ МС. На хроматограмме наблюдали четкий пик, идентифицированный как 1-(бензо[1,3]диоксол-5-ил)-N-метилпропан-2-амин.
Таким образом, было установлено, что человек употребил именно MDMA.
Далее проводилось исследование пробы 2.
В серии из трех опытов 20 мл пробы II помещали в стеклянный стакан, рН доводили до 2 раствором хлороводородной кислоты, после чего пробу настаивали на водяной бане 30 минут. После охлаждения смеси к ней добавляли 3 мл раствора трихлоруксусной кислоты для осаждения балластных веществ. Затем проводили трехкратную экстракцию в слой хлороформа. Экстракт упаривали, сухой остаток растворяли в 0,5 мл хлороформа. Концентрат исследовали с помощью ГХ МС. На хроматограмме наблюдали пик, идентифицированный как 1-(бензо[1,3]диоксол-5-ил)-N-метилпропан-2-амин, но его размер был сравним с размером пиков балластных веществ. Найти пик получилось только после изменения схемы интегрирования хроматограммы таким образом, что исследовались даже самые небольшие пики.
Для повышения чувствительности определения MDMA в моче применяли метод холодового концентрирования.
В серии из трех опытов 100 мл пробы II наливали в химический стакан, который помещали в морозильную камеру при -15 °С. После начала образования льда на поверхности жидкости каждые 10 минут верхний слой разрушали. После замерзания 2/3 жидкости пробу доставали из морозильной камеры, сливали не замерзшую жидкость. К пробе добавляли раствор хлороводородной кислоты до рН 2, помещали на водяную баню на 30 минут. После охлаждения раствора добавляли 3 мл трихлоруксусной кислоты и проводили трехкратную экстракцию в слой хлороформа. Полученное извлечение упаривали, сухой остаток растворяли в 0,5 мл хлороформа. Концентрат исследовали с помощью ГХ МС. На хроматограмме наблюдали небольшой пик, идентифицированный как 1-(бензо[1,3]диоксол-5-ил)-N-метилпропан-2-амин.
Для бо́льшего повышения чувствительности и надежности метода исследовалось двукратное холодовое концентрирование.
В серии из двух опытов 300 мл пробы II наливали в 3 стакана объемом 100 мл и помещали в морозильную камеру при температуре -15 °С. После начала образования льда на поверхности жидкости каждые 10 минут верхний слой разрушали. После замерзания 2/3 жидкости пробу доставали из морозильной камеры, сливали не замерзшую жидкость. Пробы объединяли и помещали в морозильную камеру при -15 °С, после замерзания 2/3 раствора незамерзшую жидкость сливали. Концентрат доводили до рН 2 раствором хлороводородной кислоты и помещали на водяную баню на 30 минут. После охлаждения к пробе добавляли 3 мл трихлоруксусной кислоты и доводили рН до 9 раствором гидроксида аммония 30%. После трехкратной экстракции в слой хлороформа полученное извлечение упаривали на воздухе, сухой остаток растворяли в 0,5 мл хлороформа. Концентрат исследовали с помощью ГХ МС (рис. 1, 2).
Рис. 1. Пример хроматограммы MDMA после холодового концентрирования.
Рис. 2. Масс-спектр MDMA.
На полученных хроматограммах присутствовал пик, идентифицированный как 1-(бензо[1,3]диоксол-5-ил)-N-метилпропан-2-амин. Площадь пика была достаточно большой, так что при соответствующей калибровке возможно проведение как качественного, так и количественного определения MDMA.
Выводы
Исходя из полученных результатов следует, что при анализе мочи, забор которой производился непосредственно в период активного выведения MDMA из организма, существующих методик достаточно для определения его в моче. В случае более позднего забора мочи существующие методики не могут обеспечить достаточно точное и надежное определение MDMA.
Предложенная нами усовершенствованная методика пробоподготовки включает в себя дополнительно этап холодового концентрирования.
Холодовое концентрирование - это процесс, который был изначально разработан нами для определения термолабильных алкалоидов группы псилоцина. Он позволяет повышать концентрацию искомых веществ без нагревания и существенного разрушения бо́льшей части термолабильных компонентов. После успешного внедрения методики в анализ псилоцибина и псилоцина мы изучали возможность её применения в анализе других веществ, концентрация которых в пробе относительно мала. Это, прежде всего, случаи определения токсикологически значимых веществ, которые употребляются в дозировке менее 5 мг в сутки (например, клофелин, 2С-Е, варфарин и т.д.), а также случаи, когда забор пробы производился после периода выведения бо́льшей части искомых веществ.
Методика отличается параллельной очисткой от балластных веществ и небольшими потерями - 5-10% в зависимости от физико-химических свойств искомых веществ.
Однократное холодовое концентрирование позволяет повысить чувствительность определения метилендиоксиметамфетамина. Тем не менее из-за чрезвычайно низкой концентрации аналитов надежность такой методики ниже, чем необходимо для выдачи обоснованных и однозначных результатов анализа.
Двукратное холодовое концентрирование позволяет значительно повысить чувствительность определения, но требует использования значительных объемов пробы - порядка 300 мл, что не всегда является возможным.
Полученные данные говорят о рациональности применения двукратного холодового концентрирования для надежного определения MDMA в моче при заборе пробы не позднее 56 часов после употребления наркотика. При отсутствии достаточных объемов биоматериала допустимо использование однократного холодового концентрирования, но в таком случае определение будет менее надежным, концентрации аналита не всегда достаточны для достоверного определения. Успех зависит от количества употребленного наркотика и от индивидуальных особенностей метаболизма.
Рецензенты
- Коротаев Владимир Николаевич, доктор технических наук, профессор, проректор по науке и инновациям ФГБОУ ВПО «Пермский национальный исследовательский политехнический университет», г. Пермь.
- Вайсман Яков Иосифович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой охраны окружающей среды ФГБОУ ВПО «Пермский национальный исследовательский политехнический университет», г. Пермь.