Следует сказать и об изменении в микробном фоне как следствии адаптации к применяемым препаратам. Все более часто выявляются штаммы микроорганизмов, устойчивые к традиционно используемым дезинфектантам [3,4,5].
В условиях рыночных отношений, в непростых условиях социально-экономических преобразований роль дезинфектологии как одного из путей обеспечения безопасности и здоровья человека возрастает многократно. Не вызывает сомнений, что и в XXI веке инфекционные болезни в России будут сохранять свою высокую социально-экономическую значимость, нанося ущерб здоровью людей и животных, дезорганизуя жизнь отдельных регионов страны, а в конечном счете нанося реальный экономический ущерб и регионам, и государству в целом [1,2,3,4,5].
В связи с вышеизложенным разработка новых высокоэффективных, экологически безвредных и дешевых дезинфицирующих композиций, является одним из наиболее актуальных аспектов биологической безопасности [6].
Цель исследований - изучить бактерицидное действие новых дезинфицирующих препаратов на модели Escherichia coli.
Материалы и методы
При проведении исследований использовались методики:
Методические указания о порядке испытания новых дезинфицирующих средств для ветеринарной практики; утв. ГУВ МСХ СССР 27. 12. 1987 г.
В исследованиях использовали следующие материалы:
- тест-культуру микроорганизмов: E. coli шт К-12.
- моюще-дезинфицирующие препараты: «ОМДЕЗ-1», «ОМДЕЗ-2», «СКАТ-ЭД-1», «МД-АВИА», «МУК-ДМ» и дезинфицирующий препарат «Дезостерил», представляющие собой: сбалансированный комплекс, в состав которых входят в качестве действующих веществ различные группы химических соединений, обладающих бактерицидными свойствами, а также поверхностно-активные вещества (ПАВ) в качестве моющего компонента, в опытах использовались (0,5; 1 %-ные) концентрации и 5, 10 и 15 минутные экспозиции.
Для исследования бактерицидного действия препаратов использовали кусочки обезжиренного батиста, размером 0,5 - 1,0 см, стерилизованного в автоклаве. Нужное для исследования количество стерильного батиста помещали в стерильную чашку Петри и заливали 10 - 20 мл 2-х миллиардной бактериальной суспензии.
Импрегнировали бактериальной суспензией не менее 3-х тест-объектов. После внесения тест - объектов (с культурой) в дезинфицирующие растворы и экспозиции (5,10,15 мин), проводили промывку "носителей" в стерильной дистиллированной воде. Далее производили посев на питательную среду (МПА), с последующей инкубацией в термостате. В качестве контроля бактерицидного действия изучаемого препарата использовали стерильную дистиллированную воду.
Для изучения бактерицидного действия биоцидных композиций использовали трансмиссионную электронную микроскопию. Для этого образцы фиксировали в 4 %-ном растворе параформальдегида при +4 оС в течение 48 ч. Бактериальную взвесь центрифугировали в течение 20 мин при 6000 об/мин. Тест-образцы разрезали на две части, которые складывали стопкой. Затем тест-образцы и полученный после центрифугирования осадок дофиксировали 1%-ным раствором осмиевой кислоты, обезвоживали по стандартной методике в растворах этилового спирта возрастающей концентрации и ацетоне и заливали в смесь эпон-аралдит. Ультратонкие срезы готовили на микротоме Райхерт-Янг (Австрия). Срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. Исследовали в электронном микроскопе JEM 1400 (Jeol, Япония), фотосъемку проводили с помощью встроенной цифровой камеры Jeol и цифровой камеры бокового ввода Veleta (SIS, Германия).
Результаты исследований и их обсуждение
Бактерицидным действием в 0,5 %-ной концентрации обладали: ОМДЕЗ-1, ОМДЕЗ-2, СКАТ-ЭД-1, МУК-ДМ и Дезостерил при экспозиции 15 минут, обеззараживающее действие препарата МД-АВИА проявлялось в 1 %-ной концентрации при 15 минутном воздействии. Губительное действие при использовании 1 %-ной концентрации и 5 минутной экспозиции проявлялось у ОМДЕЗ-1 и МУК-ДМ (таблица).
При изучении электроннограмм в контроле E. coli шт. К-12 морфологический анализ определил нормальную морфологию микробной клетки. Сохранены и отчетливо выявляются поверхностные мембраны клеток - волнистая клеточная стенка (черная стрелка), более светлая зона с тонкими осмиофильными нитями ДНК-нуклеоид (белая стрелка), зернистое содержимое цитоплазмы (белая фигурная стрелка) (рис № 1).
Таблица. Бактерицидное действие препаратов
|
Препарат |
Концентрация препарата в %. |
Экспозиция в (мин). |
||
|
5 |
10 |
15 |
||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
ОМДЕЗ-1 |
0,5 |
+ |
+ |
- |
|
1 |
- |
- |
- |
|
|
ОМДЕЗ-2 |
0,5 |
+ |
+ |
- |
|
1 |
+ |
- |
- |
|
|
СКАТ-ЭД-1 |
0,5 |
+ |
+ |
- |
|
1 |
+ |
- |
- |
|
|
МД-АВИА |
0,5 |
+ |
+ |
+ |
|
1 |
+ |
+ |
- |
|
|
МУК-ДМ |
0,5 |
+ |
+ |
- |
|
1 |
- |
- |
- |
|
|
Дезостерил |
0,5 |
+ |
+ |
- |
|
1 |
+ |
- |
- |
|
|
Контроль Н2О |
+ |
|||
Примечание: «+» - четкий рост; «-» - нет роста
При воздействии препарата ОМДЕЗ-1 на кишечную палочку электронномикроскопическое исследование показало, что наружная мембрана клеточной стенки отходила от протопласта, контуры ее были размыты; во внешней среде отмечали наличие осмиофильного вещества (черная стрелка), которое являлось продуктом утечки содержимого клеток. Цитоплазматическая мембрана не проявлялась. Наблюдались остатки лизированных клеток (белые стрелки) и клетки в состоянии дистрофии (серые стрелки) (рис. № 2).
При изучении ультраструктуры кишечной палочки после воздействия препарата ОМДЕЗ-2 на электроннограмме выявлялись лизированные клетки (белые стрелки) и клетки в состоянии дистрофии (черные стрелки) (рис. № 3), после воздействия на кишечную палочку препарата СКАТ-ЭД-1 наблюдались лизированные клетки с вытекшим клеточным содержимым (рис. № 4).
При воздействии препарата МД-АВИА на кишечную палочку наблюдался лизис клеток (черные стрелки) и дистрофия отдельных клеток: сегрегация цитоплазмы и выход клеточного содержимого наружу (белые стрелки) (рис. № 5).
При исследовании ультраструктуры кишечной палочки после воздействия препарата МУК-ДМ практически все бактериальные клетки находились в состоянии дистрофических изменений: наружная мембрана клеточной стенки отходила от протопласта, контуры волнистой структуры клеточной стенки не просматривались, цитоплазматическая мембрана не проявлялась, наблюдались: вакуолизация, сегрегация и резкое уплотнение отдельных зон цитоплазмы (черные стрелки). Все эти деструктивно-дегенеративные изменения приводили к дальнейшему лизису кишечной палочки (белые стрелки) (рис. № 6).
Изучение ультраструктуры кишечной палочки после воздействия препарата Дезостерил показало, что все клетки находились в состоянии тотального лизиса: наблюдались: сегрегация цитоплазмы и выход клеточного содержимого наружу (рис. № 7).
Рис. № 1. E. coli. Контроль. Нормальная морфология бактериальной клетки
Рис. № 2. E. coli после воздействия препарата ОМДЕЗ-1 в 0,5 %-ной концентрации и 15 мин. экспозиции
Рис. № 3. E. coli после воздействия препарата ОМДЕЗ-2 в 0,5 %-ной концентрации и 15 мин экспозиции
Рис. № 4. E. coli после воздействия препарата СКАТ-ЭД-1 в 0,5 %-ной концентрации и 15 мин экспозиции
Рис. № 5. E. coli после воздействия препарата МД-АВИА в 1 %-ной концентрации и 15 мин экспозиции
Рис № 6. E. coli после воздействия препарата МУК ДМ в 0,5 %-ной концентрации и 15 мин экспозиции
Рис. № 7. E. coli после воздействия препарата Дезостерил в 0,5 %-ной концентрации и 15 мин экспозиции
Заключение
По результатам проведенных исследований все препараты оказывали губительное действие на E. coli, данные электронной микроскопии показывают, что основой механизма биоцидного действия всех препаратов в отношении E. coli является мембраноатакующее действие, активные вещества, входящие в состав препарата обладают дистрофически-деструктивным действием в отношении составных компонентов клеточной стенки бактерий.
В дальнейшем будет продолжено изучение бактерицидного действия исследуемых препаратов на моделях других микроорганизмов.
Рецензенты:
- Плешакова Валентина Ивановна, доктор ветеринарных наук, зав. кафедрой ветеринарной микробиологии, вирусологии и иммунологии ИВМиБ ФГБОУ ВПО ОмГАУ им. П. А. Столыпина, г. Омск.
- Бажин Михаил Аристоклевич, доктор ветеринарных наук, профессор ГНУ Всероссийского НИИ бруцеллеза и туберкулеза животных, г. Омск.