Большинство работ по изучению активности фагоцитов крови при туберкулезе проводились давно - в 70-е - 80-е годы прошлого века. Параметры фагоцитоза при этом оценивались на основании использования двух основных тестов. Первый позволял определять функциональную активность клеток по ее способности связывать на своей поверхности, поглощать и переваривать микробную тест-культуру [3], второй - характеризовал метаболические особенности клетки при выявлении продукции супероксиданиона в реакции с нитросиним тетразолием в двух вариантах: спонтанном и стимулированном стафилококком или частицами латекса [1]. Несмотря на широкую распространенность, недостатком обеих методик остается субъективность микроскопического учета результата, вопросы стандартизации условий проведения, необходимость работы с живой микробной культурой, а также небольшое количество клеток, исследуемое данным методом (обычно не более 100).
В последнее время появились новые методы определения состояния фагоцитов, позволяющие провести независимую оценку большого количества клеток - до миллиона - в ходе проведения одного анализа.
Целью данной работы стало изучение возможностей проточной цитофлюориметрии в оценке фагоцитарной активности клеток крови при туберкулезе легких.
Материал и методы исследования
Проведено проспективное исследование 39 человек, которые были распределены на три группы. Две из них проходили лечение в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Уральский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации» города Екатеринбурга (директор - докт. мед. наук С. Н. Скорняков): I группа - 14 человек с впервые выявленным диагнозом инфильтративный туберкулез и локализацией процесса в пределах одной доли легкого, II группа - 15 пациентов с впервые выявленным диагнозом туберкулез легкого, сопровождавшийся формированием туберкуломы (ограниченный патологический процесс). В первой и второй группе заболевание вызывалось, в том числе лекарственно, устойчивыми штаммами микобактерий туберкулеза. На момент обследования пациенты не имели острой сопутствующей патологии, хроническая находилась в стадии ремиссии. III группа (контрольная) состояла из 10 практически здоровых людей - доноров крови. Все три группы были сопоставимы по возрасту (21 - 73 года) и гендерному распределению, а также прошли стандартное клинико-рентгенологическое и лабораторное обследование согласно порядку оказания медицинской помощи больным туберкулезом (Приказ Минздравсоцразвития России №1224н от 29 декабря 2010 г. «Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи больным туберкулезом в Российской Федерации»).
Кровь для анализа бралась однократно утром натощак из локтевой вены. В качестве антикоагулянта использовали ЭДТА (динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты), для оценки фагоцитарной активности использовали литий-гепарин. Экспрессия поверхностных антигенов и фагоцитарная способность клеток оценивались сразу после взятия крови.
Субпопуляции лимфоцитов определялись методом проточной цитофлюориметрии на приборе COULTER®Epics®XL (Beckman Coulter, USA), при помощи моноклональных антител той же фирмы. Лизис эритроцитов осуществлялся с использованием автоматической станции пробоподготовки Coulter® Q-Prep (Beckman Coulter, USA). Подсчет абсолютного числа клеток проводили с применением флуоросфер Flow-Count (Beckman Coulter, USA). Контроль качества осуществляли с помощью калибровочных частиц Flow-Check (Beckman Coulter, USA). Для исключения аутофлюоресценции образцов использовали изотипический контроль IgG1-FITC/IgG1-PE (Beckman Coulter, USA). Для детекции лейкоцитов применяли линейный дифференцировочный маркер CD45+ (кластер дифференцировки). Подсчитывали общее количество Т-лимфоцитов (CD45+CD3+), число Т-цитотоксических клеток (CD45+CD3+CD8+), Т-хелперов (CD45+CD3+CD4+), TNK-клеток (CD45+CD3+CD16+56+), определяли количество В- (CD45+CD19+) и NK-клеток (CD45+CD3-CD16+56+). Рассчитывали иммунорегуляторный индекс (CD4+/CD8+). На Т-лимфоцитах также оценивали экспрессию маркеров активации с использованием меток CD25+ и СD HLA-DR+. Поглотительную способность нейтрофилов и моноцитов оценивали методом проточной цитофлюориметрии согласно инструкциям, прилагаемым к наборам Phagotest® (производства ORPEGEN Pharma, BD Bioscience) и BurstTest Kit - PhagoBurst (Glycotope Biotechnology, GmbH), в состав которых входили FITC-меченые (флюоресцеин изотиоционат) опсонизированные бактерии (E. coli). Измерялось общее количество фагоцитирующих моноцитов и гранулоцитов (поглощение одной или более бактерий одной клеткой).
Статистическая обработка результатов проведена с использованием программы Microsoft Excel 2007 (Microsoft® Windows® XP Professional, USA) и программы «STATISTICА» v. 6.0 (StatSoft, USA). Вычисляли основные статистические константы, совокупность данных представляли в виде среднего значения (1), 1 и 3 квартили (2), минимального (3) и максимального значения (4), а также медианы (5). Ввиду наличия малой выборки в исследовании проверку статистических гипотез осуществляли с использованием непараметрических методов (критерий Манна - Уитни, Колмогорова - Смирнова и Вальда - Вольфовица), уровень значимости принимался равным р<0,001.
Результаты исследования и их обсуждение
Известно, что микобактерии туберкулёза не выделяют какой-либо экзотоксин, который мог бы стимулировать фагоцитоз, поэтому реакция микро- и макрофагов отмечается, когда концентрация возбудителя увеличивается значительно [6]. В таких условиях она не является адекватной, так как бактерицидный потенциал клеток недостаточно высокий. Подобное снижение числа нейтрофильных гранулоцитов отмечалось нами у больных, как с инфильтративной формой туберкулеза, так и у пациентов с туберкуломами (табл. 1).
Таблица 1
ФАГОЦИТАРНАЯ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ ОБСЛЕДОВАННЫХ ПАЦИЕНТОВ
|
Группы больных |
Гранулоциты, % |
Гранулоциты, 109/л |
Фаготест |
Бурсттест Е.соli |
||
|
Фагоцитирующие гранулоциты, % |
Фагоцитирующие гранулоциты, 109/л |
Фагоцитирующие гранулоциты, % |
Фагоцитирующие гранулоциты, 109/л |
|||
|
I группа n=14 |
60,571 (57,20-69,80)2 34,383 71,794 61,005 р<0,0001 |
4,44 (3,29-5,75) 1,62 7,24 4,26 р<0,0001 |
74,02 (59,20-92,10) 28,80 96,80 84,40 р<0,0001 |
3,25 (1,88-4,88) 0,60 5,90 3,04 р<0,0001 |
97,03 (96,35-97,35) 96,10 98,70 96,80 р<0,001 |
4,86 (3,63-5,69) 1,90 9,31 4,84 р<0,0001 |
|
II группа n=15 |
57,15 (51,04-62,75) 41,69 72,08 54,88 р<0,0005 |
3,57 (2,70-4,34) 1,76 6,94 3,64 р<0,0001 |
72,87 (61,00-93,20) 8,10 99,70 84,00 р<0,0001 |
2,78 (1,77-3,88) 0,23 5,83 2,84 р<0,0001 |
60,87 (31,30-93,80) 24,10 98,20 61,70 р<0,0001 |
2,20 (0,99-3,50) 0,67 4,74 1,72 р<0,0001 |
|
III группа n=10
|
59,13 (53,74-65,25) 44,00 70,00 59,35 |
4,54 (3,15-5,49) 2,33 8,48 3,66 |
90,38 (85,73-96,98) 72,70 97,60 93,95 |
4,10 (2,65-5,14) 2,19 7,08 3,49 |
72,59 (46,80-97,58) 17,10 99,60 88,40 |
3,45 (1,84-4,50) 0,53 8,45 3,04 |
Где 1 - среднее значение, 2 - 1 и 3 квартили, 3 - минимальное значение, 4 - максимальное значение, 5 - медиана.
В частности, у пациентов II группы число нейтрофилов снижалось на 57,1 %, при инфильтративном туберкулезе - на 49,8 %. Понижался также фагоцитарный потенциал клеток: число фагоцитирующих нейтрофилов у пациентов II группы уменьшалось в 2,5 раза в фаготесте и в 4,9 раза в бурсттесте. Похожая картина отмечалась и у пациентов с инфильтративным туберкулезом: число фагоцитирующих нейтрофилов в фаготесте было ниже в 2,3 раза, в бурсттесте - в 1,7 раза в сравнении с данными у здоровых людей (табл. 1).
Вторым этапом взаимодействия между микобактериями туберкулеза и организмом является участие в патологическом процессе макрофагов (табл. 2).
Таблица 2
ФАГОЦИТАРНАЯ АКТИВНОСТЬ МОНОЦИТОВ ОБСЛЕДОВАННЫХ ПАЦИЕНТОВ
|
Группы больных |
Моноциты, % |
Моноциты, 109/л |
Фаготест |
Бурсттест Е.соli |
||
|
Фагоцитирующие моноциты, % |
Фагоцитирующие моноциты, 109/л |
Фагоцитирующие моноциты, % |
Фагоцитирующие моноциты, 109/л |
|||
|
I группа n=14 |
8,971 (7,02-10,45)2 5,793 13,384 8,805 |
0,65 (0,47-0,81) 0,18 1,18 0,60 р<0,0001 |
55,65 (45,80-61,50) 30,40 76,30 59,70 р<0,0001 |
0,36 (0,19-0,43) 0,12 0,70 0,39 р<0,0001 |
55,63 (51,30-68,20) 13,00 72,50) 54,50 р<0,0001 |
0,34 (0,24-0,42) 0,13 0,71 0,29 р<0,01 |
|
II группа n=15 |
8,53 (7,34-9,54) 4,49 14,50 8,19 |
0,51 (0,41-0,60) 0,26 0,83 0,48 р<0,01 |
55,63 (41,60-68,50) 22,00 99,00 55,30 р<0,0001 |
0,28 (0,19-0,33) 0,11 0,65 0,26 р<0,0001 |
48,96 (20,95-75,85) 12,10 93,90 49,50 р<0,0001 |
0,23 (0,12-0,34) 0,06 0,44 0,23 р<0,0001 |
|
III группа n=10
|
6,91 (5,95-10,00) 2,00 10,00 7,00 |
0,51 (0,36-0,85) 0,16 0,85 0,45 |
65,12 (57,20-76,55) 39,30 81,80 63,80 |
0,34 (0,22-0,46) 0,09 0,69 0,29 |
64,22 (55,43-91,70) 29,80 91,70 65,80 |
0,35 (0,17-0,50) 0,09 0,71 0,30 |
Где 1 - среднее значение, 2 - 1 и 3 квартили, 3 - минимальное значение, 4 - максимальное значение, 5 - медиана.
Синтез микобактериями сульфатов и факторов вирулентности приводит к нарушению функций лизосом, что вызывает поврежедния макрофагов. В отличие от ранее описанной реакции нейтрофильных фагоцитов, число которых понижалось, количество моноцитов у больных туберкулезом, напротив, увеличивалось (табл. 2). В большей степени такая картина отмечалась у пациентов I группы - в среднем на 33,0 %, но была выявлена и при ограниченном процессе (6,5 %). По данным фаготеста и бурсттеста отмечались однонаправленные изменения у пациентов с туберкуломами - в фаготесте регистрировалось снижение количества фагоцитирующих клеток на 11,5 %, в бурсттесте - на 24,8 %. Другая картина при оценке фагоцитоза была выявлена у больных с инфильтративным туберкулезом: увеличение фагоцитарной активности наблюдалось в 1,3 раза в фаготесте и снижение на 17,2 % в бурсттесте (табл. 2). Вполне вероятно, что обнаруженные различия связаны со стадией патологического процесса.
Следующими в развитие патологического процесса вовлекаются лимфоциты (табл. 3). Интерлейкин-1, выделяемый активированными макрофагами, инициирует Т-лимфоциты, прежде всего Т-хелперы (CD4+), которые вместе с цитотоксическими Т-лимфоцитами (CD8+) сенсибилизируются, выделяя хемотоксины, гамма-интерферон и интерлейкин-2, стимулирующие миграцию макрофагов, их бактерицидную активность и увеличивая популяцию B-лимфоцитов.
Таблица 3
ОСНОВНЫЕ СУБПОПУЛЯЦИИ ЛИМФОЦИТОВ ОБСЛЕДОВАННЫХ ПАЦИЕНТОВ
|
Группы больных |
Лейкоциты, 109/л |
Лимфоциты, % |
Лимфоциты, 109/л |
Т-тимфоциты (CD45+СD3+), % |
Т-тимфоциты (CD45+СD3+), *109/л |
B-лимфоциты (CD45+СD19+), % |
B-лимфоциты (CD45+СD19+), *109/л |
NK-клетки (СD3-СD(16+56)+), % |
NK-клетки (СD3-СD(16+56)+), *109/л |
|
I группа n=14 |
7,171 (6,10-8,70) 2 2,903 10,304 7,405 р<0,0001 |
30,43 (24,00-33,20) 17,49 51,62 30,39 р<0,0001 |
2,08 (1,82-2,26) 0,80 3,45 2,04 р<0,0001 |
73,83 (72,60-77,40) 49,80 86,50 74,80 р<0,0009 |
1,50 (1,44-1,68) 0,61 2,15 1,48 р<0,0001 |
9,75 (6,70-11,50) 3,30 22,80 7,60 р<0,0001 |
0,20 (0,13-0,23) 0,07 0,51 0,17 р<0,0001 |
16,62 (9,00-19,60) 4,90 43,00 16,20 р<0,0001 |
0,39 (0,16-0,43) 0,06 0,15 0,32 р<0,0001 |
|
II группа n=15 |
6,25 (4,80-7,40) 3,20 10,60 6,50 р<0,0001 |
34,27 (29,15-40,25) 19,69 52,08 34,09 р<0,0001 |
2,17 (1,26-3,03) 0,97 3,32 2,22 р<0,0001 |
80,00 (76,58-84,98) 61,40 88,10 81,05 |
1,60 (0,88-2,44) 0,75 2,92 1,27 р<0,0001 |
9,70 (5,03-13,80) 2,50 16,20 10,70 р<0,0001 |
0,17 (0,11-0,20) 0,06 0,43 0,15 р<0,0001 |
11,09 (7,55-12,65) 0,70 31,70 9,60 р<0,01 |
0,22 (0,10-0,33) 0,08 0,47 0,22 р<0,01 |
|
III группа n=10 |
7,47 (5,83-8,63) 5,30 12,40 6,00 |
32,96 (28,00-37,47) 18,00 48,00 33,00 |
2,34 (1,98-2,80) 1,46 2,80 2,31 |
77,54 (69,30-83,60) 65,20 85,20 82,40 |
1,82 (1,45-2,04) 1,11 2,63 1,95 |
11,86 (8,80-15,80) 4,20 19,80 10,30 |
0,28 (0,18-0,32) 0,11 0,52 0,26 |
11,02 (6,80-25,20) 3,80 25,20 9,40 |
0,26 (0,12-0,36) 0,08 0,50 0,22 |
Где 1 -среднее значение, 2 - 1 и 3 квартили, 3 - минимальное значение, 4 - максимальное значение, 5 - медиана.
Очевидно, что в нашем случае, при недостаточной активации макрофагов фагоцитоз становится неэффективным. Клетки не контролируют размножение микобактерий, нарушается баланс в иммунной защите (табл. 3). В частности, отмечалось снижение числа лимфоцитов у больных с туберкуломами на 3,9 %, при инфильтративном туберкулезе - на 11,7 %, регистрировалось значительное уменьшение количества Т- и В-лимфоцитов (соответственно в I группе на 24,1 % и 34,6 %, во II группе - на 34,9 % и 42,2 %). Среди Т-лимфоцитов наиболее значимым оказалось снижение CD4+ и CD8+-клеток - в среднем на 24-25 % у всех больных (табл. 4).
Таблица 4
ОСНОВНЫЕ СУБПОПУЛЯЦИИ Т-ЛИМФОЦИТОВ ОБСЛЕДОВАННЫХ ПАЦИЕНТОВ
|
Группы больных |
Т-хелперы (СD3+СD4+), % |
Т-хелперы (СD3+СD4+), 109/л |
Т-цитотоксические клетки (СD3+СD8+), % |
Т-цитотоксические клетки (СD3+СD8+), 109/л |
Т-NK клетки СD3+СD(16+56)+, % |
Т-NK клетки СD3+СD(16+56)+, 109/л |
Иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+, отн. ед. |
|
I группа n=14 |
top
4,49
46,381 (39,70-51,40)2 35,003 57,404 74,305 р<0,0005 |
0,95 (0,81-1,08) 0,39 1,37 0,94 р<0,0001 |
25,60 (22,60-32,00) 13,50 39,90 25,80 р<0,002 |
0,52 (0,44-0,63) 0,21 0,94 0,47 р<0,0001 |
16,62 (9,00-19,60) 4,90 43,00 16,20 р<0,0005 |
0,39 (0,16-0,43) 0,06 1,52 0,32 р<0,0001 |
2,02 (1,30-2,40) 0,90 4,10 1,90 |
|
II группа n=15 |
49,42 (43,15-56,53) 30,40 64,40 50,45 р<0,002 |
0,99 (0,57-1,31) 0,45 1,96 0,87 р<0,0001 |
27,86 (20,80-31,93) 16,20 40,60 28,25 р<0,0001 |
0,57 (0,30-0,91) 0,17 1,20 0,46 р<0,0001 |
11,09 (7,55-12,65) 0,70 31,70 9,60 р<0,01 |
0,22 (0,10-0,33) 0,01 0,47 0,22 р<0,01 |
1,98 (1,28-2,43) 0,90 3,90 1,85 |
|
III группа n=10 |
46,30 (45,50-49,30) 32,10 60,20 46,40 |
1,07 (0,89-1,29) 0,68 1,32 1,16 |
29,60 (23,50-32,50) 18,50 45,50 31,50 |
0,71 (0,51-0,83) 0,36 1,41 0,62 |
11,02 (6,80-11,90) 3,80 25,20 9,40 |
0,26 (0,12-0,36) 0,08 0,50 0,22 |
1,69 (1,40-2,10) 0,80 2,60 1,60 |
Где 1 - среднее значение, 2 - 1 и 3 квартили, 3 - минимальное значение, 4 - максимальное значение, 5 - медиана.
Воспалительная реакция приобретала распространённый характер - лейкоцитоз увеличивался у больных с инфильтративной формой туберкулеза - в 1,3 раза (табл. 3).
Важной особенностью наблюдаемого явления стало увеличение числа NK- и TNK-клеток (табл. 3, 4). При этом у больных I группы нарастание касалось в одинаковой степени обеих популяций этих клеток - повышение отмечалось в среднем в 1,5 раза. У пациентов II группы в меньшей степени это касалось NK-клеток - повышение составило 2 % - и в большей TNK-клеток - 1,7 раза.
В оценке маркеров активации Т-клеток нами было установлено, что большая роль принадлежала CD25+клеткам. Их количество соответственно увеличивалось в группах I и II в 4,9 и в 1,9 раза в сравнении с контрольной группой. Преобладание активированных клеток отмечалось при инфильтративной форме туберкулеза в пределах одной доли легких, что не может не отражать активности патологического процесса и, как следствие, может быть использовано для прогнозирования течения туберкулеза (табл. 5).
Маркеры поздней активации в сравнении с контрольной группой экспрессировались на клетках реже на 28 % у пациентов с туберкуломами и на 44 % - у больных с инфильтративным туберкулезом, что могло являться одной из причин снижения миграции фагоцитов в зону повреждения, так как только активированные клетки являются источником продукции медиаторов межклеточных взаимодействий (табл. 5). Эти данные также сопоставимы с результатами, характеризующими субпопуляционный состав лейкоцитов (табл. 3,4).
Таблица 5
АКТИВИРОВАННЫЕ Т-ЛИМФОЦИТЫ ОБСЛЕДОВАННЫХ ПАЦИЕНТОВ
|
Группы больных |
Т-клетки с рецептором к IL-2 (СD3+СD25+), % |
Т-клетки с рецептором к IL-2 (СD3+СD25+), 109/л |
Т-клетки активированные (СD3+СDHLA-DR+), % |
Т-клетки активированные (СD3+СDHLA-DR+), 109/л |
|
I группа n=14 |
4,641 (3,00-5,60)2 1,303 12,604 3,705 р<0,001 |
0,09 (0,05-0,12) 0,04 0,23 0,07 р<0,0001 |
2,98 (2,40-3,80) 0,60 5,40 3,00 р<0,03 |
0,06 (0,03-0,08) 0,01 0,12 0,07 р<0,0001 |
|
II группа n=15 |
1,96 (1,05-1,80) 0,00 10,20 1,45 |
0,04 (0,01-0,05) 0,00 0,20 0,03 р<0,0001 |
0,78 (0,23-0,60) 0,00 5,10 0,45 р<0,0001 |
0,02 (0,01-0,02) 0,00 0,15 0,09 р<0,0001 |
|
III группа n=10
|
0,83 (0,63-0,98) 0,20 2,00 0,75 |
0,02 (0,01-0,03) 0,01 0,04 0,02 |
1,12 (0,35-0,83) 0,00 5,70 0,50 |
0,03 (0,10-0,15) 0,00 0,18 12,50 |
Где 1 - среднее значение, 2 - 1 и 3 квартили, 3 - минимальное значение, 4 - максимальное значение, 5 - медиана.
Таким образом, получены данные, позволяющие сделать заключение о следующем. Изменения у больных с инфильтративным туберкулезом сопровождаются выраженной воспалительной реакцией, снижением числа нейтрофилов (в 2 раза), со значительным понижением фагоцитарной активности этих клеток (до 2,3 раза), выраженной моноцитарной реакцией (повышение на 33 %), угнетением клеточного звена иммунной системы - снижением числа Т- (на 24 %) и В- (на 35 %) клеток, активацией клеток-киллеров (NK- и TNK-клеток), что выражается в повышении их количества в 1,5 раза, отмечается выраженное увеличение числа Т-активированных клеток (СD25+) в 5 раз.
Изменения у пациентов с туберкуломами характеризуются отличительным снижением количества фагоцитирующих нейтрофилов (до 4,9 раз) и фагоцитирующих моноцитов, что наблюдается на «фоне» пониженного количества В-лимфоцитов (на 42 %) и Т-лимфоцитов (на 35 %). Участие клеточных механизмов в развитии туберкуломы отражают разнонаправленные отклонения субпопуляций Т-лимфоцитов: снижение CD4+, CD8+ и CD HLA-DR+ клеток на 25 %, и увеличение CD25+ и TNK-клеток в 1,7-1,9 раза.
Выводы
- Проточная цитофлюориметрия позволяет быстро, точно и объективно оценить фагоцитарную активность клеток крови человека.
- Оценка фагоцитарной активности клеток является важным критерием определения активности туберкулеза легких на ранних стадиях наблюдения и в процессе лечения.
- Туберкулез легких, сопровождающийся формированием туберкуломы, характеризуется значительным снижением числа нейтрофильных фагоцитов в 2,5 раза в фаготесте и в 4,9 раза в бурсттесте, выраженным уменьшением количества Т- и В-клеток, увеличением TNK-клеток.
- Инфильтративная форма туберкулеза в пределах одной доли легких сопровождается значительной воспалительной реакцией (лейкоцитоз), снижением количества Т- и В- клеток, преобладанием клеток с маркерми ранней активации (CD25+), разнонаправленными изменениями фагоцитарной активности моноцитов - увеличением в фаготесте и снижением в бурсттесте.
- Маркеры ранней активации клетки (CD25+) могут отражать активность патологического процесса и использоваться для прогнозирования течения туберкулеза легких.
Рецензенты:
- Гусев Е. Ю., доктор медицинских наук, главный научный сотрудник лаборатории иммунологии воспаления Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения Российской Академии наук», г. Екатеринбург.
- Голубев Д. Н., доктор медицинских наук, профессор кафедры фтизиатрии и пульмонологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Уральская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации», г. Екатеринбург.