Этиология расстройств аутистического спектра и умственной отсталости во многих случаях сложна и не определяется единой причиной, поэтому выявление множества генов и генных сетей, которые могут оказывать влияние на возникновение таких расстройств, значимо для лучшего понимания лежащих в основе поведенческих и когнитивных нарушений нейробиологических механизмов [10]. Расстройства аутистического спектра, сопряженные с умственной отсталостью или задержкой психического развития, являются частой причиной обращения к генетической диагностике [9]. Генетические нарушения встречаются с высокой частотой у детей с расстройствами аутистического спектра и умственной отсталостью. При этих расстройствах встречаются как цитогенетически видимые хромосомные аномалии, так и субмикроскопические вариации числа копий генома и моногенные мутации. Идентификация генов, влияющих на возникновение заболевания, позволяет выявить лежащий в его основе механизм нарушения развития. Определение функции гена может помочь в анализе нарушений развития и функционирования мозга. Однако один и тот же ген может оказывать влияние на множество процессов, происходящих в различных частях мозга. Таким образом, с точностью определить нарушение, приводящее к конкретному расстройству, возможно, только выявив сеть генов, связанных между собой и взаимовлияющих друг на друга. В настоящее время молекулярно-цитогенетическая диагностика стала неотъемлемой частью медицинской генетики и клинической психологии при оказании высокотехнологичной медицинской помощи детям, страдающим умственной отсталостью, аутизмом, врожденными пороками и микроаномалиями развития, которая позволяет выявлять различные генные и хромосомные нарушения [8].
Молекулярное кариотипирование с использованием ДНК-микрочипов - одна из наиболее современных технологий диагностики геномных и хромосомных нарушений при аутизме и умственной отсталости. В практике клинической психологии и медицинской генетики мы применяем методы высокоразрешающей сравнительной геномной гибридизации (HR CGH) и серийной сравнительной геномной гибридизации (array CGH), специально разработанные для проведения анализа микроаномалий генома (дупликации, делеции и другие микроперестройки). Эти аномалии или вариации числа копий ДНК представляют собой делеции или дупликации какого-либо участка генома. Размер их варьирует от нескольких тысяч до миллиона пар нуклеотидов и даже целой хромосомы (трисомии, моносомии); они могут включать один или множество генов. Подобные изменения в некоторых регионах хромосом могут быть доброкачественными и не проявляться фенотипически, однако вариации числа копий, являющиеся причинными факторами аутизма, чаще всего не обнаруживаются в контрольных группах [9]. Предполагается, что большая часть генов, ассоциированных с когнитивными расстройствами, скорее оказывает влияние на предрасположенность к заболеванию, чем является его непосредственными и единственными причинами; каждый отдельный ген может играть относительно небольшую роль. Возможность связать вместе совокупность действия генов зависит от знания их функций. Большое значение имеют компьютерные программы, позволяющие провести биоинформатический анализ большого объема данных. В настоящее время эта область биоинформатики активно развивается [10]. Технология array CGH позволяет обнаружить различные геномные заболевания и повышает эффективность молекулярной диагностики генетических аномалий в группах детей с пороками развития, умственной отсталостью и аутизмом с 4-5 % до 40-50 % [1,2,5]. При умственной отсталости с аутистическими расстройствами (наиболее частых формах нарушения психики у детей) применение молекулярно-цитогенетической диагностики позволило показать, что от 20 до 40 % случаев связаны с нарушениями генома, проявляющимися на хромосомном (микроскопическом и субмикроскопическом) уровне [3]. Таким образом, анализ нарушений генома у детей с аутистическими расстройствами значим для коррекции психологических и поведенческих нарушений, открывая новое направление исследований в коррекционной и медицинской психологии.
Цель исследования. Целью работы явилось определение частоты и спектра геномных и хромосомных нарушений у детей с аутистическими расстройствами с применением технологий сравнительной геномной гибридизации на хромосомах in situ и на ДНК микрочипах для разработки генетических методов нейробиологической диагностики и психологической коррекции нарушений психики y детей с аутизмом.
Результаты исследования и их обсуждение. В данной работе проведены цитогеномные исследования 150 детей с недифференцированными формами аутизма. Эта когорта больных детей была отобрана в ходе проведения комплексного клинико-психологического, цитогенетического и молекулярно-цитогенетического исследования более чем 1000 детей с идиопатическим аутизмом и умственной отсталостью. Предварительный генетический анализ был проведен с применением различных диагностических тестов на наиболее частые генные и хромосомные синдромы, ассоциированные с аутистическими расстройствами [1]. При обследовании методом HRCGH на хромосомных препаратах 100 детей с трудностями в обучении и врожденными пороками развития выявлены перестройки генома в 46 % случаев. Они включали делеции (29 случаев; 63 %), дупликации (7 случаев; 15 %), субтеломерные перестройки (7 случаев; 15 %), а также сочетанные нарушения (3 случая; 7 %), предположительно связанные с субтеломерными перестройками (рис. 1А).
Более эффективной технологией обнаружения геномных микроаномалий является серийная CGH (array CGH) на ДНК микрочипах или молекулярное кариотипирование. На рисунке 2 представлен пример обследования детей с помощью этого метода с использованием ДНК микрочипа и экспериментального протокола, описанного ранее [1,3]. Использование метода array CGH показало, что картина генетических нарушений у больных с недифференцированным аутизмом может быть более сложной, чем казалось ранее. Мы оценили частоту встречаемости и сложность геномных вариаций, обследовав этим методом 50 детей с аутизмом (рис. 1Б).
Рис.1. Результаты исследования детей с идиопатическим аутизмом и умственной отсталостью с применением сравнительной геномной гибридизации (HR CGH) на хромосомах (А) и серийной сравнительной геномной гибридизации (array CGH) на ДНК микрочипах (Б)
(А)
(Б)
Рис. 2. Результаты обследования при помощи метода array CGH: диаграммы, обозначающие хромосомы 4 (слева) и 8 (справа). Слева обозначена область делеции (потеря генетического материала короткого плеча хромосомы 4), справа - область дупликации (удвоения генетического материала в коротком плече хромосомы 8)
Методом array CGH в 44 случаях из 50 (88 %) были выявлены различные геномные аномалии и вариации (CNV - copy number variations). В 23 случаях из 44 (52 %) имелись несбалансированные геномные перестройки. Они включали делеции, дупликации, субтеломерные перестройки, а также сочетанные геномные нарушения. Большие терминальные делеции (размер 4,7-6,1 млн пар нуклеотидов) обнаружены в 4 случаях (del4pter/dup8pter; del7qter; del10qter; dup19pter). 3 случая были связаны с дупликацией (1 мальчик) и делецией (2 девочки) участка Xq28 (включая гены, контролирующие экспрессию генов в нейронах мозга). В одном случае выявлена небольшая делеция участка 2qter (<1 млн пар нуклеотидов). Остальные нарушения представляли собой более сложные перестройки в виде множественных мелких делеций и дупликаций (<0,3 млн пар нуклеотидов), расположенных на большом расстоянии от теломер. Среди них в 2х случаях наблюдалось рекуррентное совпадение делеций в 9qter и 21qter. В 4-х случаях обнаружены следующие вариации числа копий размером от 0,1 до 0,3 млн пар нуклеотидов: del1pter/del5pter; del4qter/del5qter; del1pter/del4pter/del20qter; dup16pter/del6pter. Наконец, в одном случае выявлена конституциональная геномная нестабильность, проявляющаяся в виде множественных делеций и дупликаций (размер от 1 до 2,5 млн пар нуклеотидов), включающих несколько субтеломерных регионов (1pter; 16pter; 20qter; 22qter). Эти данные позволяют предположить, что небольшие (<1 млн пар нуклеотидов) комплексные вариации числа копий последовательностей ДНК часто встречаются у детей с умственной отсталостью и расстройствами аутистического спектра.
Таким образом, использование новейших методов сканирования генома, основанных на сравнительной геномной гибридизации, позволяет с большей эффективностью определять точки разрыва при хромосомных аномалиях и выявлять микроперестройки хромосом. Серийная CGH (array CGH) позволяет также обнаружить новые геномные заболевания и, в отличие от методов кариотипирования, в несколько раз повышает эффективность молекулярной диагностики генетических аномалий в группах детей с аутизмом, пороками развития и умственной отсталостью (от 3-4 % до 40-50 %) [1,2,5]. При умственной отсталости с аутистическими расстройствами (наиболее частых формах нарушения психики у детей) применение молекулярно-цитогенетической диагностики позволило показать, что от 20 до 50 % случаев связаны с нарушениями генома, проявляющимися на хромосомном (микроскопическом и субмикроскопическом) уровне [3]. Выявленные в работе вариации числа копий представляют собой делеции или дупликации какого-либо участка ДНК. Как было уже отмечено, размер их варьирует от нескольких тысяч до миллионов пар нуклеотидов, и они могут включать от одного до нескольких десятков генов. Подобные и вариации генома могут не проявляться фенотипически. Однако вариации числа копий (CNV), являющиеся, по-видимому, в ряде случаев причинными факторами аутизма, чаще всего не обнаруживаются в контрольных группах [9].
Заключение. Таким образом, исследования геномных и хромосомных нарушений у детей с аутизмом с использованием новейших геномных технологий значимы не только для нейробиологической диагностики и поиска этиологических факторов заболевания, но также для разработки научно обоснованных методов медицинской и психологической коррекции нарушений психики.
Рецензенты:
Алфимова Маргарита Валентиновна, доктор психологических наук, в.н.с. лаборатории клинической генетики ФГБУ "Научный Центр Психического Здоровья" РАМН, г. Москва.
Троицкая Любовь Анатольевна, доктор психологический наук, профессор кафедры нейро- и патопсихологии факультета клинической и специальной психологии ГБОУ ВПО г. Москвы "Московский городской психолого-педагогический университет", г.Москва.