Нарушение регуляции процессов апоптоза и пролиферации является основным механизмом опухолевой трансформации клеток [1]. Из существующих способов визуализации и оценки пролиферативной активности клеток наиболее оптимальным является иммуногистохимическое определение индекса пролиферации, сочетающее в себе высокую информативность и невысокие экономические затраты [4].
Негистоновый протеин Ki-67, отнесенный к основным маркерам пролиферации, экспрессируется всеми клетками, вышедшими из G0-фазы клеточного цикла, что позволяет оценить «скрытый» пролиферативный потенциал изучаемого пула клеток [3].
Немногочисленные работы, посвященные изучению морфологических особенностей пролиферативных процессов в молочных железах женщин с различными формами фиброзно-кистозной болезни (ФКБ), свидетельствуют о двукратном повышении уровня экспрессии маркеров пролиферации Ki-67 и PCNA в эпителии молочной железы при пролиферативных формах ФКБ относительно непролиферативных форм заболевания [2, 3].
Риск развития рака молочной железы зависит непосредственно от выраженности пролиферации эпителиоцитов протоков и/или долек молочной железы [6]. Так, при пролиферативных локализованных формах ФКБ пациентки, как правило, подвергаются хирургическому вмешательству в объеме секторальной резекции для исключения рака молочной железы.
В последние годы в хирургической практике активно используются физические факторы - лазерное излучение, ультразвук, электромагнитное излучение, гипертермия. Наибольшую распространенность в хирургии молочной железы получило высокоинтенсивное лазерное излучение (ВИЛИ) ближнего инфракрасного диапазона (длина волны 805-1024 нм), обеспечивающее быстрое рассечение тканей с одномоментным гемостазом, а также позволяющее осуществлять лазерную интерстициальную гипертермию опухолей [5]. Однако работ, посвященных изучению интенсивности пролиферации эпителия долек и протоков молочной железы в тканях, подвергнувшихся воздействию ВИЛИ, в свете современных представлений о канцерогенезе, в доступной нам литературе не представлено, что послужило поводом к проведению данного исследования.
Цель исследования - оценить влияние высокоинтенсивного лазерного излучения ближнего инфракрасного диапазона (длина волны 805 нм) на пролиферативную активность эпителиоцитов долек и протоков молочной железы.
Материал и методы
Обследовано 102 женщины, из которых 58 пациенток составили группу сравнения, 44 - основную группу. Основная группа включала больных с фиброзно-кистозной болезнью молочных желез в возрасте от 25 до 55 лет (средний показатель - 38,4±5,2 лет), иссечение тканей при секторальной резекции у которых выполнялась с использованием ВИЛИ, генерируемого диодным лазером Sharplan-6020, с длиной волны 805 нм. Группа сравнения включала женщин с ФКБ молочных желез в возрасте от 22 до 55 лет (средний показатель 36,9±3,5 лет). Секторальная резекция у них осуществлялась посредством скальпеля.
Перед операцией, наряду с общепринятыми методами обследования, всем пациенткам выполнялись физикальное, ультразвуковое и маммографическое (после 40 лет) исследования.
Ультрасонографическое исследование молочных желез проводилось на аппарате Acusson «Aspen» с использованием линейного датчика с рабочей частотой 7,5-10 МГц.
Рентгеновская маммография выполнялась по общепринятой методике в стандартных укладках больной на аппарате фирмы «Siemens».
Тонкоигольная аспирационная биопсия для исключения рака молочной железы производилась также всем пациенткам, включенным в исследование, после завершения комплекса неинвазивных методов исследования.
Секторальная резекция молочной железы в основной группе больных выполнялась путем иссечения тканей органа с помощью ВИЛИ, доставляемого с помощью гибкого кварцевого световода диаметром 600 мкм. Мощность излучения при этом составляла 20 Вт, режим подачи излучения - импульсно-периодический - частота следования импульс/ пауза - 50/50 мс (данный режим рассечения тканей молочной железы был обоснован в проведенном нами ранее экспериментально-клиническом исследовании).
В группе сравнения пациенткам выполнялась секторальная резекция по общепринятой методике - с рассечением и иссечением тканей скальпелем.
Материал для первичного морфологического исследования получали с края резекции непосредственно во время оперативного вмешательства. Контрольное морфологическое исследование проводили через 6 месяцев после операции. Материалом для исследования являлись образцы тканей молочной железы, взятые из прилежащих к послеоперационному рубцу тканей путем трепанобиопсии полуавтоматической иглой «GBL» диаметром 16G под местной анестезией 0,5 % раствора новокаина. Забор материала осуществляли с использованием ультрасонографического контроля положения иглы в тканях относительно рубца.
Морфологическое исследование включало стандартное гистологическое исследование с окраской срезов гематоксилином и эозином и иммуногистохимический метод с количественным определением показателя экспрессии маркера пролиферации антигена Ki-67. В качестве количественного показателя маркера пролиферации определяли относительную площадь экспрессии антигена Ki-67 в эпителиоцитах молочной железы.
Относительная площадь экспрессии (S,%) антигена Ki-67 рассчитывалась как отношение площади иммунопозитивных ядер эпителиоцитов (S, ИГХ+ ядер) к общей площади ядер эпителиоцитов (S,ядер общая): S=S ИГХ+ ядер/ S ядер общая х 100 %.
Постановку иммуногистохимической реакции осуществляли по стандартному протоколу с использованием моноклональных мышиных антител к Ki-67 (Dako, Clone Ki-67, 1:25).
Статистическая обработка полученных результатов производилась на персональном компьютере «Acer» с использованием прикладной компьютерной программы BioStat 2008. Методы статистики включали расчет показателей среднего арифметического (М) и среднего отклонения (m). Оценка межгрупповых различий осуществлялась с помощью t-критерия Стьюдента, в случае малой выборки - применяли непараметрический критерий критерий Манна-Уитни с поправкой Бонферрони. Достоверными считали различия при р˂0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Стандартное гистологическое исследование операционного материала в исследуемых группах больных не выявило рака молочной железы. Распределение больных по формам ФКБ представлено в таблице 1.
Таблица 1. Распределение больных по формам фиброзно-кистозной болезни в клинических группах
|
Форма ФКБ |
Основная группа n=44 |
Группа сравнения n=58 |
|
Непролиферативная форма |
38 (86,4 %) |
52 (89,6 %) |
|
Пролиферативная форма без атипии эпителия |
5 (11,4 %) |
5 (8,6 %) |
|
Пролиферативная форма с атипией эпителия |
1 (2,2 %) |
1 (1,7 %) |
С учетом полученных данных распределение больных по группам исследования было скоррегировано - все пациентки, имеющие пролиферативные формы ФКБ, были сгруппированы в отдельную группу, для дальнейшего изучения экспрессии маркера пролиферации Ki-67 в качестве эталона при пролиферативных формах ФКБ. Таким образом, в основной группе больных осталось 38 пациенток, в группе сравнения - 52 женщины.
При анализе экспрессии маркера пролиферации Кi-67 в тканевых срезах из материала, полученного непосредственно во время операции, было выявлено, что показатель относительной площади экспрессии антигена Ki-67 у больных с непролиферативной формой ФКБ, прооперированных с помощью ВИЛИ, не отличается от таковой у женщин из группы сравнения, и составляет 19,25±2,68 % и 18,43±3,29 % соответственно (р˂0,05).
В группе больных с пролиферативными формами ФКБ (эталонная группа) величина относительной площади экспрессии антигена Ki-67 в эпителиоцитах протоков и долек практически в 2 раза превышала аналогичные показатели больных с непролиферативными формами ФКБ и составила 33,67±1,4 % против 18,43±3,29 % (р˂0,05).
Оценку влияния на пролиферативную активность эпителия протоков и долек молочных желез типа режущего инструмента (скальпеля и ВИЛИ) исследовали отсрочено - через 6 месяцев от момента хирургического вмешательства путем стандартного гистологического и иммуногистохимического исследований биоптатов тканей молочных желез, прилежащих к послеоперационному рубцу (рис. 1).
а б
Рис. 1. Иммуногистохимическая реакция выявления ядерного антигена Ki-67 в тканях молочных желез, х 400 (а - непролиферативная форма ФКБ, микропрепарат пациентки К., основной группы до операции с использованием ВИЛИ, б - непролиферативная форма ФКБ, микропрепарат пациентки К., основной группы через 6 месяцев после операции с использованием ВИЛИ). Стрелки указывают на положительную реакцию к антигену Ki-67 в эпителии молочной железы.
Показатели относительной площади экспрессии антигена Ki-67 в ядрах эпителиоцитов долек и протоков на момент операции и спустя 6 месяцев после секторальной резекции молочной железы приведены в таблице 2.
Таблица 2 Показатели относительной площади экспрессии антигена Ki-67 в ядрах эпителиоцитов на момент операции и через 6 месяцев после секторальной резекции молочной железы
|
Сроки исследования |
Величина относительной площади экспрессии антигена Кi-67 в ядрах эпителиоцитов, % |
||
|
Основная группа(1) n=38 |
Группа сравнения (2) n=52 |
Эталонная группа (3) (пролиферативная форма ФКБ) n=12
|
|
|
На момент операции |
19,25±2,68* |
18,43±3,29* |
33,67±1,4** |
|
Через 6 месяцев после операции |
20,17±3,59* |
19,94±2,96* |
34,22±2,57** |
Примечание: * - р 1-2 >0,05, использован критерий Стьюдента, ** - р1-3<0,05, использован критерий Манна-Уитни с поправкой Бонферрони.
Результаты исследования, представленные в таблице 2, свидетельствуют об отсутствии статистически значимых различий в показателях величины относительной площади экспрессии антигена Ki-67 в ядрах эпителиоцитов долек и протоков молочной железы как на момент операции, так и в отсроченные сроки наблюдения независимо от вида используемого режущего инструмента и формы фиброзно-кистозной болезни молочной железы - непролиферативной и пролиферативной (р>0,05).
Таким образом, полученные в ходе исследования данные, позволяют нам сделать вывод об отсутствии влияния высокоинтенсивного лазерного излучения, генерируемого диодным лазером с длиной волны 805 нм, на пролиферативную активность эпителиоциотов долек и протоков молочной железы, т.е. ВИЛИ данного типа не обладает канцерогенным эффектом на ткани органа и может широко использоваться в хирургии молочной железы.
Рецензенты:
- Кулаев Иван Александрович - д.м.н, профессор кафедры патологической анатомии ГБОУ ВПО «ЧелГМА Минздравсоцразвития России», г. Челябинск.
- Андриевских Игорь Аркадьевич - д.м.н., профессор, зав. кафедрой госпитальной хирургии ГБОУ ВПО «ЧелГМА Минздравсоцразвития России», г. Челябинск.