Цистеин (2-амино-3-меркаптопропановая кислота) является серосодержащей заменимой аминокислотой, участвующей в метаболических процессах в живых организмах [2]. Нарушение содержания цистеина в биохимических циклах живых организмов приводит к возникновению различных патологических процессов, нервных, психических и других заболеваний. Разработка высокочувствительных методов определения цистеина в различных объектах является важной задачей аналитической химии. В последнее время для определения цистеина все чаще используют электрохимические методы анализа благодаря их простоте, экспрессности и чувствительности. Электрохимическому определению цистеина на модифицированных электродах отдается все большее предпочтение, среди которых особое предпочтение уделяют электродам на основе переносчиков электронов. В качестве медиаторов используют различные соединения: чистые металлы, их сплавы и оксиды, комплексы металлов, полимеры и др. [5]. Например, модифицирование поверхности углеродсодержащего электрода оксидом рутения позволяет проводить определение цистеина с пределом обнаружения 1∙10-7 M [7]. При модифицировании стеклоуглеродного электрода бинарной системой золото-иридий предел обнаружения цистеина составляет 5∙10-8 M [6]. Использование наноразмерных частиц металлов в качестве модификаторов благодаря их специфическим свойствам позволяет повысить чувствительность определения и снизить предел обнаружения аминокислот [11]. Поэтому модифицирование поверхности углеродсодержащих электродов наночастицами металлов является актуальной задачей.
Целью данной работы являлось изучение возможности использования графитовых электродов, модифицированных наночастицами золота (ГЭ-Au-nano) для определения цистеина, и разработка чувствительного вольтамперометрического способа определения цистеина на ГЭ-Au-nano в водных растворах.
Экспериментальная часть
Все реактивы использовали аналитической чистоты, растворы готовили на бидистиллированной воде. Раствор цистеина готовили непосредственно перед измерениями.
Циклические вольтамперограммы регистрировали с помощью вольтамперометрического анализатора ТА-4 (ООО «ТомьАналит», г. Томск). В двухэлектродной ячейке в качестве рабочего электрода использовали графитовые электроды, модифицированные наночастицами золота (ГЭ-Au-nano) и из раствора HAuCl4 концентрацией 10 мг/л (ГЭ-Au). Электродом сравнения служил насыщенный хлоридсеребряный электрод. Вольтамперометрические измерения проводили на фоне 0,1 M NaOH.
Очистку поверхности графитового электрода (ГЭ) проводили механическим способом, используя фильтровальную бумагу.
Модифицирование поверхности ГЭ проводили следующим способом. Электрод помещают в электрохимическую ячейку, заполненную 10 мл 0,1 М раствора HCl и добавкой 0,1 мл золя золота, приготовленного по методике, описанной в [4]. При потенциале электролиза минус 1,0 В в течение 300 с проводили накопление золотых наночастиц на поверхности рабочего электрода. После модифицирования поверхности электрод вынимали из раствора, ополаскивали бидистиллированной водой и помещали в электрохимическую ячейку с 0,1 M NaOH для вольтамперометрического определения цистеина.
Результаты и их обсуждение
Золи золота - это сложные системы, состоящие из частиц сферической формы и окисленной формы металла. Размер наночастиц золота составляет 2-5 нм (рис.1).
Рис. 1. Микрофотографии золотых наночастиц
Электрохимическое поведение цистеина изучали на немодифицированном ГЭ и ГЭ-Au в растворе фонового электролита 0,1 M NaOH методом циклической вольтамперометрии (рис. 2).
Рис.2. Циклические вольтамперограммы фонового электролита (a'a'') на ГЭ и (с'с'') на ГЭ-Au; цистеина (b'b'') на ГЭ, (d'd'') на ГЭ-Au. Условия: скорость развертки 0,1 В/с, 0,1 M NaOH, с цистеина = 2·10-8 M.
Циклические вольтамперограммы цистеина регистрировали на ГЭ-Au-nano (рис. 3).
Рис. 3. Циклические вольтамперограммы фонового электролита (a'a'') и цистеина сцистеина = 2·10-12 M (b'b'') и 4·10-12 M (c'c''). Условия эксперимента: 0,1 M NaOH, скорость развертки 0,1 В/с
Как видно из представленных рисунков, на анодной ветви циклической вольтамперограммы максимум наблюдается при потенциале Ea = 0,24 В на ГЭ-Au (кривая с' рис. 2). На ГЭ-Au-nano наблюдается максимум при потенциале Ea = -0,05 В (кривая а' рис. 3), что соответствует процессу образования оксида золота (III).
На катодной ветке циклической кривой катодный максимум наблюдается при потенциале Ек= -0,14 В на ГЭ-Au (кривая c'' рис. 2). Появление же катодного максимума может быть обусловлено переходом свежеобразованного гидратированного оксида золота Au2O3 ∙ nH2O в адсорбированный монослой Au2O ∙ nH2O [10] в щелочной среде. На ГЭ-Au-nano наблюдается максимум при потенциале Eк = 0,05 В (кривая а'' рис. 3), что соответствует образованию металлического золота. Как видно, анодный максимум, полученной на ГЭ-Au-nano, смещается в область отрицательных потенциалов на 0,2 В. Катодной максимум смещается в более положительную область потенциалов на 0,1 В. Смещение потенциала в область положительных потенциалов на ГЭ-Au-nano может быть связано с окислением наночастиц золота в щелочной среде, за счет увеличения активных центров на поверхности ГЭ-Au-nano, приводящего к снижению энергии активации.
Электрохимическое поведение золота, электроосажденного на ГЭ, достаточно сложно и включает образование на поверхности ГЭ оксо- и гидроксосоединений металла в различных степенях окисления: Au(OH), Au(OH)3 или Au2O3 . Как можно увидеть из рис. 2 (кривая с') и рис. 3 (кривая а'), максимумы на анодных ветвях циклических кривых, полученных на ГЭ-Au-nano и ГЭ-Au, могут быть отнесены к золоту в степени окисления +3 с образованием оксида металла Au2O3 по схеме [9, 10]:
2Au + 6OH- D Au2O3 + 3H2O + 6e (1)
Максимум на катодной ветви циклической кривой (рис.2 с''), полученый на ГЭ-Au, описывается схемой процесса [8]:
Au2O3 + 6OH- D Au2O + 2O2 + 4e (2)
На ГЭ-Au-nano на катодной ветви наблюдается два максимума (рис. 3, кривая b''). Первый катодный максимум соответствует схеме (2). Второй максимум соответствует окислению оксида золота (I) до оксида золота (III) в щелочной среде [8], схема (3):
Au2O + 4OH- = Au2O3 + 2H2O + 4e (3)
Процесс (3) реализуется в циклическом режиме при сканировании в области потенциалов от 0.8 до -0.4 В на ГЭ-Au-nano.
Цистеин неэлектроактивен на ГЭ в 0,1 M NaOH (кривые b'b'', рис. 2). Цистеин проявляет электрохимическую активность в присутствии 2·10-8 M на ГЭ-Au. Максимум наблюдается при потенциале Ea = 0,24 В на анодной ветви циклической кривой d' (рис. 2). Высота максимума окисления цистеина на ГЭ-Au увеличивается в 1,5 раза по сравнению с высотой максимума, соответствующего окислению модификатора. На ГЭ-Au-nano цистеин электрохимически активен в присутствии 2·10-12 М. Потенциал максимума цистеина смещается в область отрицательных значений потенциала (кривая b', рис. 3) и наблюдается при потенциале 0,1 В. Этот факт связан с увеличением активных центров на поверхности ГЭ-Au-nano по сравнению с монокристаллами золота, катализирующими процессы окисления цистеина. Высота максимума окисления цистеина на ГЭ-Au-nano увеличивается на 30 % по сравнению с высотой максимума, соответствующего окислению модификатора.
Процесс, происходящий на ГЭ-Au-nano, может быть отнесен к электрокаталитическому с адсорбционным вкладом в процесс электроокисления цистеина и регенерации каталитической исходной формы по схеме:
6RSH + Au2O3 D 3RSSR + 2Au + 3H2O (4)
Положительный наклон зависимости I√v - √v указывает на адсорбционный вклад в процесс электрокаталитического окисления цистеина на ГЭ-Au-nano (рис. 4).
Рис. 4. Зависимость максимума тока икисления цистеина от скорости развертки на ГЭ-Au-nano Cцистеина= 4∙10-12 M
В присутствии 2∙10-12 M и 4∙10-12 M цистеина на ГЭ-Au-nano наблюдается обратный максимум при потенциале Eк = 0,0 В на катодных ветвях циклических кривых b'',c'' (рис. 3).
Причина появления этого обратного максимума на ГЭ-Au-nano может быть связана с окислением оксида золота из низшей степени окисления Au2O до Au2O3, аналогично процессу окисления Ag → AgO в щелочном растворе [1], или процессом электровосстановления кислорода, катализируемого осадком на поверхности электрода [12].
Было обнаружено разовое увеличение тока анодного максимума цистеина на ГЭ-Au при концентрации цистеина 2·10-8 M. На ГЭ-Au-nano наблюдается нелинейное увеличение тока анодного максимума цистеина. Катодный обратный максимум линейно зависит от концентрации цистеина в области значений от 2∙10-12 М до 14∙10-12 М на ГЭ-Au-nano, которая представлена на рис. 5.
Рис. 5. Зависимость тока максимума окисления от концентрации цистеина на ГЭ-Au-nano в 0,1 M NaOH
Предел обнаружения цистеина по 3σ-критерию равен 6·10-13 M. На основе полученных результатов был разработан вольтамперометрический способ определения цистеина в водных растворах на ГЭ-Au-nano [3].
Методика определения
10 мл 0,1 М NaOH раствора фонового электролита помещали в электрохимическую ячейку. Вольтамперограммы фонового электролита NaOH регистрировали методом циклической вольтамперометрии при следующих условиях: скорости развертки потенциала 0,1 В/с, в диапазоне изменения потенциала от -0,3 до 0,3 В. Затем в этот раствор добавляли аликвотную часть анализируемого раствора цистеина неизвестной концентрации. Полученный раствор перемешивали в течение 1 минуты и регистрировали циклические вольтамперограммы в аналогичных условиях. Далее в этот же раствор добавляли 0,02 мл 1·10-12 М стандартного раствора цистеина. Полученный раствор перемешивали в течение 1 минуты и регистрировали циклические вольтамперограммы. Каждую вольтамперограмму регистрировали по два раза. После измерения вольтамперограмм образца и добавки в области потенциалов от 0,1 до -0,1 В регистрировали максимум. По разности высот проводили расчет содержания цистеина в водных растворах.
Выводы
- Таким образом, ГЭ-Au-nano может быть использован для вольтамперометрического определения цистеина в водных пробах. Использование ГЭ-Au-nano позволяет повысить чувствительность определения цистеина по сравнению с ГЭ-Au на четыре порядка. Увеличение чувствительности определения цистеина на ГЭ-Au-nano связано с увеличением числа атомов на поверхности ГЭ по сравнению с монокристаллами золота, катализирующими процесс окисления цистеина.
- Обнаружен обратный максимум на катодной ветви циклической кривой на ГЭ-Au-nano. Линейная зависимость тока обратного максимума от концентрации цистеина наблюдается в области (1-14)∙10-12 М с пределом обнаружения 0,610-12 М в 0,1 M NaOH.
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке программы «Разработка технологий получения всех биоактивных и биорезестентных материалов для медицины» (шифр 3.10.2012).
Рецензенты:
- Ковалева Светлана Владимировна, д.х.н., профессор, зав. каф. неорганической химии ТГПУ, биолого-химический факультет Томского государственного педагогического университета, г. Томск.
- Ильин Александр Петрович, д.ф.-м.н., профессор, и.о. зав. каф. общей и неорганической Института физики высоких технологий ТПУ, Институт физики высоких технологий Национального исследовательского Томского политехнического университета, г. Томск.