Нами были проведены фармакогностические исследования сырья. Корни Rosacanina (L.) для исследований заготавливались осенью в пределах естественного ареала. Установлены показатели подлинности, доброкачественности и нормы качества сырья. Для установления показателей подлинности сырья проводился макроскопический и микроскопический анализ по методикам, изложенным в ГФ XI издания [2]. Были определены внешние и установлены микро-диагностические признаки сырья [4]. Для определения товароведческих показателей сырья использовали фармакопейные методики [2]. Наибольшее содержание экстрактивных веществ установлено при экстрагировании 40 % спиртом этиловым. Результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1. Товароведческие показатели корней Rosacanina L.
|
Числовые показатели |
Содержание, % |
Установленная норма,% |
|
Влажность |
9,63±0,12 |
Не более 10 % |
|
Зола общая |
2,86±0,019 |
Не более 3 % |
|
Зола, нерастворимая в 10% растворе HCL |
0,95 ± 0,82 |
Не более 1 % |
|
Примеси органические |
Не более 1 % |
Не более 1 % |
|
Примеси минеральные |
Не более 1 % |
Не более 1 % |
|
Экстрактивные вещества (экстрагент - 40 % спирт этиловый) |
25,62±1,435 |
Не менее 25 % |
В результате фитохимического анализа нами установлено присутствие в исследуемом сырье органических кислот, пектиновых веществ, водорастворимых полисахаридов, тритерпеновых сапонинов, дубильных веществ, аминокислот, определен макро- и микроэлементный состав.
Для получения качественного препарата из лекарственного растительного сырья и прогнозирования эффективности равновесных способов экстрагирования необходимо располагать сведениями о товароведческих и технологических показателях данного растительного сырья, о характере экстрагента и об условиях экстрагирования. Технологические показатели сырья включают информацию о коэффициентах поглощения (Кп) и образования внутреннего сока (К), о коэффициенте увеличения объема при растворении экстрактивных веществ (Z) и содержании экстрактивных веществ (X). Для определения Кп, К и Z использовали методику, разработанную Пшуковым Ю. Г. [1]. За окончательный результат показателя принимали среднее арифметическое трех параллельных определений.
Результаты оценки качества сырья по товароведческим и технологическим показателям были определены следующие: G - масса сырья - 49,98 г; В - влажность сырья - 9,63 %; X - содержание экстрактивных веществ в сырье - 25,97 %; f - масса экстрагента, взятого для экстракции - 158,0 г; V - объем экстрагента, взятого для экстракции - 173 см3; р - плотность экстрагента - 0,9736 г/см3; рр - плотность растворителя - 0,948 г/см3; ри - плотность извлечения - 0,9585 г/см3; p1 - концентрация спирта в экстрагенте - 20,0 % по объему; р - концентрация спирта в экстрагенте - 33,33 % по массе; Рр - концентрация спирта в растворителе - 32,37 % по массе; а - объем слитого извлечения - 53,21 см3; d - масса слитого извлечения - 51,0 г; с - масса извлечения, взятого на анализ - 16,5145 г; V1 - объем извлечения, взятого на анализ - 17,23 см3; b - привес бюкса - 1,1435 г; Кп - коэффициент поглощения сырья, - 2,39 см3/г; К - коэффициент образования внутреннего сока - 2,69 см3/г; Z - коэффициент увеличения объема - 0,89 см3/г.
Рассчитанные технологические показатели сырья: коэффициенты поглощения, образования внутреннего сока, увеличения объема при растворении экстрактивных веществ являются основой для теоретических расчетов эффективности экстракции и нормирования качества экстракта жидкого корней Rosacanina (L.).
С целью определения оптимальных размеров частиц сырья корней шиповникабыл проведён фракционный состав, с дальнейшим исследованием в каждой из фракций содержания дубильных веществ фармакопейной перманганатометрической методикой [2]. С целью извлечения суммы основных биологически активных соединений были использованы экстрагенты, обладающие различной растворяющей способностью, что обеспечило получение комплексов с различным содержанием дубильных веществ. Установлено, что для получения экстракта жидкогокорней Rosacanina (L.) следует использовать в качестве экстрагента спирт этиловый 40 % , сырьё со степенью измельчения 2 мм, соотношение сырья и экстрагента - 1:2. Для получения экстракта жидкого использовали способ реперколяции с завершенным циклом в модификации по Н.А. Чулкову, где число ступеней соответствует числу диффузоров в батарее. Нами рассчитаны условия, обеспечивающие высокую эффективность экстракции. Расчёт фактической эффективности экстракции проводили по формуле:
, где
Q - масса сырья, введенного в производство (г);
х - содержание дубильных веществ в сырье - корнях шиповника собачьего (%);
ε - общий объем извлечения (см3);
с - содержание дубильных веществ в жидком экстракте из корней шиповника (%).
Количественно оценивали фактическую эффективность экстрагирования (Sф), сравнивая ее с теоретической(S) относительно эффективности экстрагирования «So». Условия экстрагирования, при которых S0 ≥ 0,9 могут считаться оправданными, а при более низких значениях «S0» нуждаются в улучшении.
Результаты проведенных исследований показывают, что эффективность экстракции фактическая близка к теоретически вычисленной. Экспериментальные данные позволяют обосновать возможность получения жидкого экстракта корней шиповника Rosacanina (L.) в промышленном производстве по разработанной технологии.
Нами определены нормы качества полученного экстракта. Экстракт представляет собой жидкость тёмного цвета, своеобразного запаха и терпкого вкуса. Жидкие экстракты согласно нормативной документации оценивают по содержанию действующих веществ, тяжёлых металлов, сухого остатка, спирта или плотности [2]. В соответствии с этим полученный экстракт жидкий был подвергнут всем перечисленным испытаниям. Установлено содержание спирта - 67,83 %, сухого остатка - 6,57 %. Используя химические и физико-химические методы (БХ, ТСХ, ВЭЖХ) разработаны способы качественного и количественного определения биологически активных веществ, содержащихся в фитопрепарате. Для установления подлинности полученного экстракта использован ряд цветных реакций на основные биологически активные вещества, наличие которых определили в сырье. Так как в доминирующем количестве содержатся: дубильные вещества, органические кислоты и тритерпеновые сапонины, провели испытания на указанные биологически активные вещества. Готовили водный раствор экстракта (1:10). Присутствие дубильных веществ доказывали по реакциям с железоаммонийными квасцами (черно-синее окрашивание), раствором ацетата свинца 10 %, с желатином и бромной водой; сапонины - по реакции пенообразования в щелочной и кислой среде, реакции Сальковского, Лафона, спиртовым раствором холестерина 1 %. Для подтверждения наличия органических кислот проводили хроматографический анализ на бумаге восходящим методом в системе н - бутанол - кислота муравьиная - вода (250:25:297). В качестве свидетелей использовали 1 спиртовые растворы щавелевой, янтарной, винной, лимонной, яблочной кислот. Проявляли хроматограммы 0,1 % раствором бромфеноловогосинего в 96 % спирте этиловом (рН 6,7). При проявлении органические кислоты окрашиваются в ярко-желтый цвет на голубовато-синем фоне. Идентификацию органических кислот проводили по величинам Rf, сопоставляя с Rfаутентичными образцами.
Количественное определение дубильных веществ проводили фармакопейным перманганатометрическим методом [2], содержание в экстракте жидком корней шиповника собачьего Rosacanina L. составляет 4,91±0,02 % .Относительная ошибка при доверительной вероятности не превышает ±0,47 %. В связи с тем, что перманганатометрический метод по ГФ ХI позволяет определить не только содержание дубильных веществ, а сумму всех легко окисляемых соединений, переходящих в водное извлечение, нами для стандартизации жидкого экстракта из корней шиповника собачьего был использован метод высокоэффективной жидкостной хроматографии как более точный и информативный метод качественного и количественного анализа. Для определения танина в экстракте использовали микроколоночный жидкостный хроматограф «Милихром А-02», снабжённый колонкой из нержавеющей стали размером 2х75 мм, заполненный адсорбентом Prontosil 120-5CAQ. Анализ проводили методом изократического элюирования при комнатной температуре. В качестве подвижной фазы использовали систему растворителей кислота муравьиная 2 % - ацетонитрил (60:40). При хроматографировании в предложенных условиях раствора РСО танина 0,1 % фиксировались два симметричных пика со временем удерживания 1,85 и 2,45 мин, коэффициент разделения пиков составил 2,1.
Метрологические характеристики количественного определения танина методом ВЭЖХ в исследуемом экстракте были следующие:N=5; f=4; 
=0,744%; S=0,0096; S =0,0043; ΔX=0,009558; ε=±1,28 %. На основе полученных данных были предложены условия хроматографического анализа и проверена пригодность разработанной методики по параметрам: точность, воспроизводимость, линейность. В результате исследований, в исследуемом экстракте содержание танина составило 0,744 %.
Предварительными фармакологическими исследованиями установлена его антибактериальное, антиоксидантное действие, и согласно комбинированной табуляции классов токсичности Hodge и Sterner разработанный экстракт жидкий отнесен к группе малотоксичных веществ, что показывает его перспективность в качестве лекарственного средства [3].
Рецензенты:
Ившина И. Б., д.б.н., зав. кафедрой алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН, профессор кафедры микробиологии и иммунологии ПГНИУ, г. Пермь.
Солонинина А. В., д.фарм.н., профессор, зав. кафедрой управления и экономики фармации факультета дополнительного профессионального образования ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия», г. Пермь.