Ген Viviparous1 (Vp1) является одним из важных регуляторов позднего эмбриогенеза у мягкой пшеницы [1]. Ген Vp1 кукурузы и риса способствуют транскрипции многих регулируемых абсцизовой кислотой (АБК) генов в развивающемся алейроне [1; 7; 8]. Фенотипы мутантов кукурузы по гену Vp1 свидетельствуют о том, что ген выполняет две различные функции: первая - обеспечение созревания зародыша, вторая - регуляция перехода семени в покой и репрессия прорастания. Три гена-гомолога Vp1 клонированы и секвенированы у мягкой пшеницы [9]. Анализ структуры и экспрессии этих трёх генов показал, что каждый из них потенциально кодирует полноразмерную цепь аминокислот. Однако некорректный сплайсинг проматричной РНК приводит к аберрантным продуктам трансляции. Исследование уровня экспрессии гена Vp1 в созревающих зародышах устойчивых и неустойчивых к доуборочному прорастанию сортов выявило положительную корреляцию между покоем семян и чувствительностью к АБК [10]. McKibbin и др. (2002) сообщили, что неправильный сплайсинг пре-мРНК TaVp1 происходит вокруг домена B3, приводя к синтезу аберрантных мРНК с наличием стоп-кодонов в открытой рамке считывания (ORF) [11].
Анализ структуры и функционирования гена Vp1 у различных злаков может дать новые сведения о механизмах взаимодействия генетических систем в организме, а также понять принципы регуляции важнейшего процесса - толерантности к прорастанию на корню. Все это в целом позволит разработать биоинженерные и другие подходы к регуляции прорастания зерновых на корню. Таким образом, исследования гена Vp1 у диких сородичей пшеницы может послужить как для изучения функционирования данного гена у различных видов, что приблизит нас к понимаю всех сторон его функциональных особенностей, так и в дальнейшем для направленного трансгеноза или отдаленной гибридизации для интрогрессии в пшеницу генов, обеспечивающих устойчивость её к прорастанию на корню.
Генетические ресурсы важны для поддержания мирового производства пшеницы как в настоящий момент, так и в будущем. Это понятие включает широкий диапазон генетического разнообразия, необходимого для усиления потенциала урожайности пшеницы. Генетические ресурсы открывают доступ к новым источникам устойчивости и толерантности к биотическим и абиотическим стрессам.
Современные высокоурожайные сорта пшеницы представляют собой сочетания генов или генных комбинаций, собранных селекционерами, использующими, в большинстве случаев, хорошо приспособленные сорта собственных регионов. Международные исследования в аграрной сфере значительно расширили доступность высокоадаптивных генетически разнообразных ресурсов для селекции мягкой пшеницы. Интрогрессия дополнительной вариации, обнаруженной в генетических ресурсах, необходима для увеличения стабильности получаемого урожая и дальнейшего улучшения пшеницы.
В качестве доноров хозяйственно-ценных признаков в отдалённой гибридизации пшеницы в разное время использовалось несколько видов пырея. Среди видов рода Thinopyrum наиболее ценными для отдалённой гибридизации с пшеницей представляются пырей средний Th. intermedium (JJJSJSSS, 2n = 6x = 42) и пырей понтийский Th. ponticum (JJJJJJJSJSJSJS, 2n = 10x = 70).
Целью нашей работы было прямое клонирование и сравнительный анализ области В3 домена гена Viviparous1 у Th. intermedium и Th. ponticum.
Материалы и методы
Растительный материал
В работе использовали образец Th. intermedium PI 547312 и Th. ponticum PI 401200 (полученные из Germplasm Research International Network).
Выделение ДНК
ДНК выделяли из молодых листьев и корешков по методу Bernatzky и Tanksley [12].
ПЦР, клонирование, секвенирование
В работе использовались следующие праймеры: VP-1BB4F и VP-1BB4R. Условия амплификации: первоначальная денатурация 5 минут при 94 °С, далее 35 циклов при следующих условиях 95 °С - 1 мин, 66 °С - 1 мин, 72 °С - 1 мин, и конечная элонгация в течении 10 минут при 72 °С.
Лигирование амплифицированной ДНК осуществляли с помощью pGEM®-T Easy Vectors. Секвенирование проводили на приборе ABI-3130XL. Выравнивание сиквенсов проводили с использованием программы GenDoc. Поиск гомологий и построение филогенетических деревьев - с помощью программного обеспечения BLAST и Lasergene.
Результаты и обсуждение
При проведении ПЦР с праймерами VP-1BB4F и VP-1BB4R, комплементарными к шестому экзону и пятому интрону гена Viviparous1 у субгенома В мягкой пшеницы на всех исследуемых образцах Th. intermedium и Th. ponticum были получены продукты амплификации различного размера. Нами были клонированы и секвенированы все ПЦР-продукты, амплифицируемые на видах Th. intermedium и Th. ponticum.
Для образцов Th. intermedium были получены различные сиквенсы, которые укладывались в три варианта, поэтому мы посчитали целесообразным выделить у Th. intermedium три аллельных варианта этого участка гена Viviparous1 (рис. 1). Как видно на рисунке 1, полученные нами сиквенсы на Th. intermedium в основном различаются в своей неинформативной интронной части, а в участке нуклеотидной последовательности, относящейся к экзону, больших различий не наблюдается, кроме одно-нуклеотидные замены. Подобная картина наблюдалась и в предыдущей нашей работе по анализу гена Viviparous1 у видов Thinopyrum elongatum, Thinopyrum bessarabicum, Pseudoroegneria stripifolia, Dasypyrum villosum [13]. При этом следует отметить, что именно полиморфизм в этой области интрона у белозерных пшениц вызывает различия в устойчивости к прорастанию на корню [11]. Это связывают с альтернативным сплайсингом при наличии определенного полиморфизма в интронах. Таким образом, на функционирование гена Viviparous1 оказывает влияние не только информация, закодированная в экзонах, но и наблюдающийся полиморфизм в интронах.
Рис. 1. Выравнивание трех аллельных вариантов участка гена Viviparous1, выявленных у аллелей Thinopyrum intermedium. Цветом обозначен конец интрона (красный) и начало экзона (синий)
Для образцов Th. ponticum были получены различные сиквенсы, которые укладывались в четыре варианта нуклеотидных последовательностей различных аллелей (рис. 2). При этом следует отметить, что в отличие от сиквенсов, полученных нами на видах Th. intermedium, Th. elongatum, Th. bessarabicum, Pseudoroegneria stipifolia, Dasypyrum villosum, у Th. ponticum наблюдалось достаточно существенное разнообразие в области шестого экзона (рис. 2). Так, у последовательности Th. pont1 в районе экзона имеется вставка размером 427 п.н. Таким образом, можно предположить, что функционирование данного аллеля может существенно отличаться от функционирования аллелей гена Viviparous1, известных к настоящему времени.
Рис. 2. Выравнивание четырех аллельных вариантов участка гена Viviparous1, выявленных у аллелей Thinopyrum ponticum. Цветом обозначен конец интрона (красный) и начало экзона (синий)
При построении филогенетических деревьев с участием полученных в нашей работе сиквенсов мы установили, что все они попадают в один кластер с последовательностями к виду мягкой пшеницы Triticum aestivum (рис. 3). Cиквенсы генов-гомологов Vp1 мягкой пшеницы различных субгеномов оказались в различных кластерах, в то время как сиквенсы пырея среднего и пырея понтийского были объединены в один кластер. Полученные нами результаты согласуются с данными Cai и Jones [14], в соответствии с которыми субгеномы пырея понтийского и среднего J, S и Js ближе друг к другу, чем субгеномы мягкой пшеницы A, B и D. На себя обращает внимание кластеризация выявленных нами последовательностей пырея понтийского и пырея удлиненного с опубликованной последовательностью Triticum aestivum vp1D, которая относится к D-субгеному мягкой пшеницы, что согласуется с данными о близости D-субгенома и субгеномов St и J пырея [15]. Таким образом, полученные нами результаты способствуют установлению филогенетических и эволюционных связей между различными видами пырея и мягкой пшеницы.
Рис. 3. Кластеризация полученных нами сиквенсов участка гена Viviparous1 с известными сиквенсами злаковых культур
Клонированные и охарактеризованные нами последовательности ДНК могут служить отправной точкой для клонирования полноразмерных генов-ортологов у изучаемых видов. Как известно, одним из способов повышения устойчивости к прорастанию на корню может быть внедрение в геном мягкой пшеницы генов Vp1 из различных видов злаков при межвидовой и отдаленной гибридизации. Благодаря высокой скрещиваемости наиболее привлекательными для этой цели являются различные виды пырея.
Таким образом, полученные нами нуклеотидные последовательности смогут послужить для создания молекулярных маркеров для оценки влияния различных генов Viviparous1 пырейного происхождения на прорастание семян злаковых, а в дальнейшем и для интрогрессии их в геном пшеницы.
Выводы
- Полученные сиквенсы ортологов гена Viviparous1 у Thinopyrum ponticum и Thinopyrum intermedium имеют высококонсервативные последовательности в области экзона и полиморфны в области интрона.
- Нами выделены три аллельных варианта гена Viviparous1 у Thinopyrum intermedium и четыре аллельных варианта у Thinopyrum ponticum.
- Полученные сиквенсы участка гена Viviparous1 у Thinopyrum ponticum и Thinopyrum intermedium попадают в кластер к виду Triticum aestivum.
Работа выполнена при финансовой поддержке Федерального агентства по образованию в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», государственный контракт П598 от 06 августа 2009 г. «Конструирование ДНК-библиотеки генов гомологов гена Vp-1 (viviparous) злаковых культур и её характеристика». Работа была выполнена с использованием оборудования ЦКП «ВНИИСБ»
Рецензенты:
- Соловьев А.А., д.б.н., профессор, зав. кафедрой генетики и биотехнологии РГАУ МСХА им. К.А. Тимирязева, г. Москва.
- Джалилов Ф.С., д.б.н., профессор, зав. лабораторией защиты растений РГАУ МСХА им. К.А. Тимирязева, г. Москва.
Работа получена 30.08.2011