Одним из средств базисной терапии у больных ХПН является эритропоэтин (ЭПО), его применение основано, прежде всего, на эритропоэтических эффектах и коррекции анемии. В последнее время объектом пристального внимания являются неэритропоэтические плейотропные эффекты ЭПО. Так, выявлено влияние ЭПО на сердечно-сосудистую, центральную нервную систему, систему гемостаза, аффективный статус [4,5,6]. Обнаруженные плейотропные эффекты ЭПО могут быть связаны с процессами свободно-радикального окисления (СРО).
Цель работы: исследовать состояние процессов свободно-радикального окисления у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, и оценить роль ЭПО в их коррекции.
Материалы и методы: Первоначально обследовано 160 больных с терминальной стадией ХПН в возрасте от 22 до 72 лет (средний возраст 45,5 лет), находящихся на постоянном лечении в отделении диализа ГМЛПУЗ «Челябинская областная клиническая больница». После рандомизации в исследование включено 62 больных, из них 29 женщин и 33 мужчины. Группа 1 - контроль (n=25) представлена здоровыми людьми - донорами областной станции переливания крови г. Челябинска, не имеющими соматической патологии и сопоставимыми по возрасту и полу с основными группами. Группа 2 - больные ХПН, не принимающие ЭПО, до процедуры гемодиализа (n=24). Группа 3 - больные ХПН, не принимающие ЭПО после процедуры гемодиализа (n=24). Группа 4 - больные ХПН, принимающие ЭПО, до процедуры гемодиализа (n=38). Группа 5 - больные ХПН, принимающие ЭПО, после процедуры гемодиализа (n=38). Кровь для исследований у больных 2 - 5 групп забиралась из артериального колена артерио-венозной фистулы. Больные 4 и 5 группы получали ЭПО в составе препарата «Рекормон» (МНН: эпоэтин бэта, «Roche» Швейцария) 2 раза в неделю внутривенно в разовой дозе 2000-4000 МЕ в течение 2 месяцев, суммарная доза составила около 40000 МЕ. Продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ) определяли спектрофотометрическим методом в изопропанольной и гептановой фракциях липидного экстракта плазмы [2]. Результаты выражали в единицах экстинции против оптического контроля при 220 нм, 232 нм и 278 нм, отражающих соответственно поглощение изолированных двойных связей, диеновых коньюгатов ацилгидроперекисей, кетодиенов и сопряжённых триенов. Кроме этого, вычисляли индексы окисления - Е232/Е 220 (относительное содержание диеновых коньюгатов), Е278/Е220 (относительное содержание кетодиенов и сопряженных триенов). Конечные продукты ПОЛ определяли путем дополнительного замера оптической плотности экстракта при 400 нм. Уровень конечных продуктов перекисного окисления липидов - шиффовых оснований (ШО) оценивали по соотношению Е400/Е220. Активность супероксиддисмутазы (СОД) в сыворотке крови определяли по методу С. Чевари и др. Активность каталазы в сыворотке крови исследовали по способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный продукт жёлтого цвета. Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных программ «Statistica v. 6.0 for Windows». Проверку значимости различий между группами проводили с использованием критериев Манна-Уитни и Вальда-Вольфовитца.
Результаты исследования и их обсуждение. Установлено, что у больных с терминальной стадией ХПН до процедуры диализа наблюдается активация процессов СРО, о чем свидетельствует накопление продуктов ПОЛ в гептановой фракции липидного экстракта плазмы, а именно диеновых конъюгатов ацилгидроперекисей и кетодиенов и сопряженных триенов, т.е. соответственно первичных и вторичных продуктов ПОЛ (табл.1).
Таблица 1. Содержание продуктов перекисного окисления липидов в гептановой фракции плазмы у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, и влияние ЭПО на их уровень (M±m)
|
Группы / показатели |
Группа 1: здоровые(n=25) |
Группа 2: ХПН до диализа(n=24) |
Группа 3: ХПН после диализа(n=24) |
Группа 4: ХПН+ЭПО до диализа (n=38) |
Группа 5: ХПН+ЭПО после диализа (n=38) |
|
Е220, у.е./мл |
1,72±0,17 |
1,98±0,17 |
1,95±0,19 |
1,82±0,19 |
2,31±0,23 |
|
Е232, у.е./мл |
1,03±0,08
|
1,94±0,15 р1<0,001 |
1,77±0,14 р1<0,001 |
1,34±0,15 р2<0,001 |
1,66±0,18
|
|
Е278, у.е./мл |
0,19±0,02
|
0,44±0,06 р1<0,001 |
0,49±0,05 р1<0,001 |
0,27±0,03 р2=0,009 |
0,28±0,04 р3=0,004 |
|
Е400, у.е./мл |
0,16±0,02
|
0,25±0,03
|
0,19±0,01
|
0,14±0,02 р2=0,008 |
0,11±0,01 р3<0,004 |
|
Е232 / Е220 |
0,64±0,02
|
1,10±0,13 р1<0,001 |
1,34±0,25 р1=0,005 |
0,72±0,04 р2<0,001 |
0,69±0,03 р3=0,01 |
|
Е278 / Е220 |
0,11±0,01
|
0,24±0,03 р1=0,006 |
0,29±0,04 р1<0,001 |
0,18±0,03
|
0,16±0,03 р3<0,001 |
|
Е400 / Е220 |
0,11±0,01
|
0,14±0,02 р1=0,01 |
0,15±0,03
|
0,08±0,01 р2=0,02 |
0,15±0,04
|
Примечание. Здесь и далее р - показатель значимости различий между группами по критерию Манна-Уитни (WW - критерию Вальда-Вольфовитца).
Как известно, гептановая фракция концентрирует большую часть резервных липидов (триацилглицеридов). В изопропанольной фракции липидного экстракта плазмы, которая аккумулирует основное количество мембранных фосфолипидов, повышено содержание первичных и вторичных продуктов ПОЛ как в относительных, так и в абсолютных величинах (табл. 2).
Таблица 2. Содержание продуктов перекисного окисления липидов в изопропанольной фракции липидного экстракта плазмы у больных ХПН, находящихся на гемодиализе и влияние ЭПО на их уровень (M±m)
|
Группы / показатели |
Группа 1: здоровые(n=25) |
Группа 2: ХПН до диализа(n=24) |
Группа 3: ХПН после диализа(n=24) |
Группа 4: ХПН+ЭПО до диализа (n=38) |
Группа 5: ХПН+ЭПО после диализа (n=38) |
|
Е220, у.е./мл |
4,82±0,59
|
9,68±0,86 р1<0,001 |
8,79±1,10 р1<0,001 |
11,41±0,83 р1<0,001 |
8,10±0,71 р1<0,001 |
|
Е232, у.е./мл |
2,39±0,30
|
7,08±0,49 р1<0,001 |
6,02±0,65 р1<0,001 |
6,22±0,39 р1<0,001 |
5,66±0,41 р1<0,001 |
|
Е278, у.е./мл |
1,42±0,11
|
2,94±0,15 р1<0,001
|
2,37±0,30 р1<0,001 р2=0,01 |
1,40±0,07 р1<0,001 р2=0,02 |
0,77±0,05 р1<0,01 р4<0,001 |
|
Е400, у.е./мл |
0,26±0,03
|
0,27±0,04
|
0,30±0,04
|
0,21±0,03 р2<0,001 (WW) |
0,18±0,03 р3=0,01
|
|
Е232 / Е220 |
0,51±0,02
|
0,78±0,09 р1=0,008
|
0,75±0,07 р1=0,003
|
0,60±0,04 р2=0,005 (WW) |
0,78±0,09 р1=0,008
|
|
Е278 / Е220 |
0,30±0,01
|
0,35±0,03 р1=0,01 (WW) |
0,39±0,07 р1=0,04
|
0,27±0,01 р2<0,001 (WW) |
0,37±0,05
|
|
Е400 / Е220 |
0,06±0,01
|
0,04±0,01 р1=0,01 (WW) |
0,06±0,01 р1=0,04
|
0,02±0,01 р1=0,04 р2=0,002 |
0,02±0,01 р1=0,04 р3<0,001 |
Процедура гемодиализа не оказывает значимого влияния на уровень продуктов ПОЛ в липидных экстрактах плазмы, в единичном порядке отмечено снижение абсолютного содержания кетодиенов и сопряженных триенов в изопропанольной фракции, однако пересчет показателя на индекс окисления Е278 / Е220 не подтвердил этого факта.
Процессы свободно-радикального окисления включают не только прооксидантные системы, активность которых фиксируется по содержанию продуктов ПОЛ, но и систему антиоксидантной защиты с многочисленными представителями как в плазме, так и в клетках организма. Рядом авторов указывается, что оксидативный стресс у больных ХПН не корригируется гемодиализной процедурой и связан в значительной мере не только с активацией продукции радикалов, но и со снижением активности антиоксидантной системы [8]. В тоже время, Hirayama А. et al. приводят данные о том, что повышенные ТБК-позитивные продукты плазмы после диализа снижаются до уровня здоровых людей. Нами показано, что у больных ХПН независимо от процедуры диализа в плазме снижается активность каталазы и Cu, Zn - зависимой супероксиддисмутазы (табл. 3).
Таблица 3. Активность ферментов антиокислительной системы плазмы у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, и влияние ЭПО на их уровень (M±m)
|
Группы / показатели |
Группа 1: здоровые(n=26) |
Группа 2: ХПН до диализа(n=24) |
Группа 3: ХПН после диализа(n=24) |
Группа 4: ХПН+ЭПО до диализа (n=38) |
Группа 5: ХПН+ЭПО после диализа (n=38) |
|
СОД, Ед/мл |
0,87±0,11
|
0,44±0,02 р1<0,001 |
0,47±0,02 р1<0,001 |
0,53±0,03 р1<0,001 р2=0,01 |
0,51±0,01 р1<0,001
|
|
Каталаза, мкат/л |
17,88±0,72
|
6,52±0,47 р1<0,001 |
9,79±2,49 р1<0,001 |
13,58±2,00 р1<0,001 р2<0,001 |
12,51±2,18 р1<0,001 р3<0,001 (WW) |
Отметим преимущественное снижение активности каталазы (в среднем на 64 %) по сравнению с СОД (в среднем на 49 %). Корреляционный анализ позволил установить, что содержание продуктов ПОЛ в плазме увеличивается по мере падения активности ферментов антиокислительной системы, причем, статистически значимые связи больше характерны для СОД, чем для каталазы (табл. 4). Это согласуется с данными о значимости СОД как фермента «аварийного звена» антиоксидантной защиты [3]. Повышение активности НАДФН-оксидазы и депрессия функции СОД в ряде работ рассматривается как универсальный механизм окислительного стресса при ХПН [7].
Таблица 4. Корреляционная матрица между активностью ферментов антиокислительной системы плазмы и содержанием продуктов ПОЛ в липидном экстракте плазмы у больных ХПН
|
Показатели |
Каталаза, мкат/л |
СОД, Ед/мл |
|
Е232 / Е220 гептановая фракция |
R=-0,50 р<0,05 R=0 |
R=-0,63 р<0,05 R=-0,04; р>0,05 |
|
Е232 / Е220 изопропанольная фр. |
R=-0,43 р<0,05 R=-0,17; р>0,05 |
R=-0,10 р>0,05 R=-0,44; р<0,05 |
|
Е278 / Е220 гептановая фракция |
R=-0,31 р>0,05 R=-0,30 р>0,05 |
R=-0,51 р<0,05 R=-0,55; р<0,05 |
|
Е278 / Е220 изопропанольная фр. |
R=-0,03 р>0,05 R=-0,18 р>0,05 |
R=-0,32 р>0,05 R=-0,12; р>0,05 |
|
Е400 / Е220 гептановая фракция |
R=-0,01 р>0,05 R=-0,41 р<0,05 |
R=-0,55 р<0,05 R=-0,18; р>0,05 |
|
Е400 / Е220 изопропанольная фр. |
R=0,06 р>0,05 R=-0,66 р<0,05 |
R=-0,46 р<0,05 R=-0,39; р>0,05 |
Примечание. В числителе значения R - коэффициента корреляции Спирмена, р - показатель значимости связи до процедуры гемодиализа, в знаменателе - после гемодиализа.
Применение ЭПО у больных ХПН изменяет содержание в плазме продуктов пероксидации липидов (табл. 1, 2). При исследовании продуктов ПОЛ в гептановой фракции плазмы выявлено, что до процедуры гемодиализа снижается содержание первичных, вторичных и конечных интермедиатов ПОЛ, определяемых соответственно на длинах волн 232 нм, 278 нм и 400 нм. Пересчет показателей относительно изолированных двойных связей обнаружил снижение только гидроперекисей липидов - первичных продуктов и оснований Шиффа (конечных продуктов). При анализе продуктов ПОЛ в водно-спиртовой (изопропанольной) фракции плазмы, аккумулирующей структурные липиды, выявлено в условиях применения ЭПО снижение в абсолютных величинах только конечных продуктов ПОЛ, а при пересчете на индексы окисления - всего спектра интермедиатов ПОЛ. После процедуры гемодиализа в гептановой фракции плазмы снижается содержание первичных и вторичных продуктов ПОЛ, в изопропанольной фракции - только конечных. Вероятно, в ходе процедуры гемодиализа дополнительная активация прооксидантных систем приводит к накоплению продуктов ПОЛ, преимущественно в изопропанольной фракции.
Полученные результаты могут свидетельствовать как о прямых, так и опосредованных эффектах ЭПО на выраженность процессов СРО у больных ХПН, находящихся на гемодиализе. Прямое действие ЭПО может реализоваться через вмешательство в активность клеток и плазменных факторов, входящих в состав про- и антиоксидантных систем, опосредованное - через увеличение количества эритроцитов, восстановление кислородообеспечения клеток, снижение выраженности уремической интоксикации и др. В пользу предположения о прямом антиоксидантном эффекте ЭПО свидетельствует его влияние на активность ферментов антиоксидантной защиты (табл. 3). Действительно, в условиях применения ЭПО у больных ХПН повышается активность в плазме СОД и каталазы, причем наблюдается более значимый прирост каталазы (+108 %), а не СОД (+20 %). Однако, активность обоих ферментов все-таки не достигала уровня здоровых людей. Ряд исследователей также высказывают предположение о прямом антиоксидантном действии ЭПО. При экспериментальном синдроме ишемии-реперфузии ЭПО снижает целый ряд показателей оксидативного стресса (МДА, эндотелиальной NO-синтазы) и повышает уровень каталазы. Интересные данные были опубликованы в июне 2011 г. группой итальянских ученых Cassis P. et al. при экспериментальной модели ишемии-реперфузии после трансплантации почек у крыс: оказалось, что цитопротекторный эффект ЭПО в отношении нефроэпителия канальцев нефрона реализуется, в том числе, за счет его антиоксидантного действия, причем он более выражен у СЕРО - карбамилированного производного ЭПО, т.е. не связан с его эритропоэтическим действием. Полагают, что ЭПО может оказывать антиоксидантный эффект за счет активации внутриклеточных механизмов, таких как гемоксигеназа-1 и глютатионпероксидаза, также может снижать внутриклеточное содержание железа (II). Jin W. et al. (2011) вскрыты еще более интимные механизмы прямого антиоксидантного действия ЭПО: в эксперименте при черепно-мозговой травме протекторный эффект ЭПО в отношении легочной ткани реализуется посредством активации антиоксидантного транскрипционного ядерного фактора-2 (Nrf-2) и как следствие изменением активности НАД(Ф)Н-оксидоредуктазы, глутатион-S-трансферазы α-1 и гемоксигеназы-1, что позволило авторам обозначить ЭПО как фактор с антиоксидантным и дезинтоксикационным действием.
Таким образом, установлено, что у больных с терминальной стадией ХПН, находящихся на постоянной заместительной терапии гемодиализом, наблюдается активация процессов СРО, о чем свидетельствуют увеличение в гептановой фракции липидного экстракта плазмы вторичных продуктов ПОЛ, в изопропанольной фракции - первичных и вторичных продуктов ПОЛ, а также снижение активности каталазы и Cu, Zn - зависимой супероксиддисмутазы в плазме. Процедура гемодиализа не оказывает значимого влияния на уровень продуктов ПОЛ в липидных экстрактах плазмы и активность ферментов антиокислительной защиты. Применение ЭПО у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, приводит к снижению содержания первичных, вторичных и конечных интермедиатов ПОЛ в гептановой и изопропанольной фракции липидного экстракта плазмы, повышаению активности в плазме супероксиддисмутазы и каталазы.
Список литературы
- Бикбов, Б.Т., Томилина, Н.А. Состояние заместительной почечной терапии больных с хронической почечной недостаточностью в Российской Федерации в 1998-2007 гг. (Аналитический отчет по данным Российского регистра заместительной почечной терапии) / Б.Т. Бикбов, Н.А.Томилина // Нефрология и диализ. - 2009. - Том . 11. - С. 144-233.
- Волчегорский, И.А. Экспериментальное моделирование и лабораторная оценка адаптивных реакций организма / И.А. Волчегорский, И.И. Долгушин, О.Л. Колесников и др. - Челябинск: Издательство Челябинского государственного педагогического университета, 2000. - 167 с.
- Дубинина, Е.Е. Характеристика внеклеточной супероксиддисмутазы / Е.Е. Дубинина // Вопр. мед. химии. - 1995. - № 6. - С. 8-12.
- Захаров, Ю.М. Цитопротекторные функции эритропоэтина / Ю.М. Захаров // Клиническая нефрология. - 2009. - № 1. - С. 16-21.
- Осиков, М.В. Патофизиологический анализ влияния эритропоэтина на психологический статус у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе / М.В. Осиков, К.В. Ахматов, Л.В. Кривохижина // Вестник Южно-Уральского государственного университета. Cepия «Oбpaзовaниe, здpaвooxpaнeниe, физичecкaя кyльтypa». - 2010. - №19 (195), Вып. 23. - С. 92 - 96.
- Осиков, М.В. Влияние эритропоэтина на тромбоцитарно-лейкоцитарные взаимодействия и экспрессию тромбоцитарных гликопротеинов у больных с терминальной почечной недостаточностью / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. - №2/1. - С. 56-57.
- Annuk, M. Oxidative stress markers in pre-uremic patients / M. Annuk, B. Fellstrom, O. Akerblom et al. // Clin. Nephrol. - 2001. - Vol. 56, № 4. - P. 308-314.
- Morena, M. Overproduction of reactive oxygen species in end-stage renal disease patients: a potential component of hemodialysis-associated inflammation / M. Morena, S. Delbosc, A.M. Dupuy et al. // Hemodial. Int. - 2005. - Vol. 9, № 1. - P. 37-46.
- Sindhu, R.K., Ehdaie A., Farmand F. et al. Expression of catalase and glutathione peroxidase in renal insufficiency / R.K. Sindhu, A. Ehdaie, F. Farmand et al. // Biochim. Biophys. Acta. - 2005. - Vol. 1743(1-2). - P. 86 - 92.
- Vaziri N.D. Oxidative stress in uremia: nature, mechanisms, and potential consequences / N.D. Vaziri // Semin. Nephrol. - 2004. - Vol. 24(5). - P. 469 - 473.
Рецензенты:
- Телешева Л.Ф., д.м.н., профессор, проректор по научной работе и международным связям ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Росздрава», г. Челябинск.
- Попов Г.К., д.м.н., профессор, заместитель директора Челябинского государственного института лазерной хирургии по научной работе, г. Челябинск.
Работа получена 22.07.2011.