Введение. В мире ежегодно регистрируется более 325 000 новых случаев и 57 000 летальных исходов меланомы кожи – агрессивной злокачественной опухоли нейроэктодермального происхождения [1]. Эта нозология является одной из наиболее опасных среди онкологических патологий, характеризуется низкой 5-летней выживаемостью, эффективностью стандартной терапии, в которую входят ингибиторы BRAF/MEK - дабрафениб и траметиниб, и ростом заболеваемости (прогнозируемое увеличение на 25% к 2034 г.) [2-4].
Протеинкиназа BRAF является частью сигнального пути RAS-RAF-MEK-ERK (MAPK). Молекулярные ингибиторы регулярно одобряются Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) для лечения опухолей, и большинство из них нацелены на подавление пролиферации и метаболизма опухолевых клеток. Путь RAS–RAF–MEK–ERK является консервативным сигнальным путем, который играет жизненно важную роль в выживании и дифференцировке клеток. Аберрантная активация сигнального пути RAS–RAF–MEK–ERK вызывает опухоли. Около 33% опухолей содержат мутации RAS, в то время как 8% опухолей вызваны мутациями RAF. За последние десятилетия были приложены большие усилия для воздействия на этот сигнальный путь для лечения рака [5]. Мутации BRAF приводят к активации сигнального пути MAPK, и вследствие этого происходит стимуляция пролиферации, подавление апоптоза и неопластическая трансформация. Выявление мутаций в этом гене служит показанием к назначению BRAF-ингибиторов.
Открытие роли пути RAS/RAF/MEK/ERK в меланомогенезе открыло новую эру в лечении этой опухоли. Вемурафениб был первым специфическим ингибитором киназы, одобренным для терапии меланом, содержащих мутации, активирующие BRAF, за ним последовали дабрафениб и энкорафениб. Однако, несмотря на превосходные результаты ингибиторов киназы первого поколения в комбинации с ингибиторами MEK с точки зрения скорости ответа, средняя продолжительность ответа была короткой из-за генетических и эпигенетических механизмов резистентности [6].
Важно понимать, что и другие молекулярно-генетические аномалии (кроме мутаций в генах сигнального пути MAPK) могут приводить к стимуляции клеточного деления и неопластической трансформации, в то числе вариации копийности генов (CNV) [4]. Вариация числа копий генов (CNV, copy number variation) - особый тип полиморфизмов, изменяющий количество копий определенного генетического локуса и, соответственно, его экспрессию. Исследователями накоплены значительные объемы данных о копийности генов сигнального пути MAPK в клетках опухолей [4; 7]. Так, например, высокая экспрессия мРНК BRAF, а также высокий уровень числа копий этого гена связаны с поздними стадиями опухоли и неблагоприятным прогнозом при раке молочной железы [8]. А изменение числа копий генов BRAF и NRAS играет неотъемлемую роль в патогенезе меланомы [9].
Исходя из описанного выше целью исследования стало изучение особенностей копийности некоторых генов сигнальных путей MAPK и PI3K при меланоме кожи, связанных с эффективностью терапии BRAF/MEK-ингибиторами.
Материалы и методы исследования
На биоинформационном этапе исследования был выполнен анализ открытой базы данных TCGA (The Cancer Genome Atlas, https://www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/tcga), содержащей информацию о 470 больных меланомой (n=470), для выявления особенностей аномальной копийности генов в меланоме кожи, ассоциированных с эффективностью терапии BRAF/MEK-ингибиторами. Данные о числе копий генов были получены из Genomic Data Commons Data Portal (https://portal.gdc.cancer.gov/) с помощью TCGABiolinks (R v.4.0.0, Rstudio). Алгоритм GISTIC был использован для обнаружения областей генома, размер которых значимо изменялся в ряде опухолевых образцов [9; 10].
Для экспериментальной части исследования использовали срезы тканей из FFPE (Formalin-fixed paraffin-embedded)-блоков 317 больных меланомой кожи и 20 образцов свежезамороженных тканей пациентов с доброкачественными новообразованиями кожи (невусы). Пациенты получали ингибиторы BRAF/MEK по следующей схеме: дабрафениб 150 мг 2 раза в сутки и траметиниб 2 мг 1 раз в сутки в течение 12 месяцев. Выявленные в TCGA аномалии CNV валидировали методом RT-PCR на 327 образцах ДНК, а также проводили секвенирование по Сэнгеру на наличие мутаций в гене BRAF у этих пациентов.
Определение уровня относительной копийности генетических локусов. Фенол-хлороформную экстракцию применяли для выделения 327 образцов ДНК, которую, после нормализации, использовали для определения относительной копийности генов методом ПЦР в режиме реального времени (Real-Time qPCR). С использованием базы данных NCBI GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) и онлайн-инструмента Primer-BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) были разработаны последовательности синтетических олигонуклеотидов, в том числе для референсных локусов (ACTB, GAPDH) (табл. 1).
Таблица 1
Перечень синтетических олигонуклеотидов (праймеров) для определения числа копий генов
|
Ген |
Праймер (5'->3') |
Размер ампликона (п.о.) |
Область |
|
Grb2 |
F: AGTGGAGATGCGGGAGAAC |
~150 |
Интрон |
|
SOS1 |
F: CCTCTTTGGCTGCTGACATG |
~120 |
Интрон |
|
KRAS |
F:TGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTCA |
~130 |
Промотор/ Интрон |
|
NRAS |
F: GGTGAAACCTGTTTGTTGGAC |
~110 |
Интрон |
|
BRAF |
F: TCCCTCTCAGGCATAAGGTAA |
~160 |
Интрон |
|
MEK1 |
F: CAGCTTCAGCTGTGGTTTCC |
~140 |
Интрон |
|
ERK2 |
F: TGGCTACACCTTCGACATCG |
~180 |
Интрон |
|
PKA (PRKACA) |
F: GTGGTCAGAGCCATCAAGGG |
~100 |
Интрон |
|
PI3K (PIK3CA) |
F: CCTCTTGCTGTTTCACCA |
~200 |
Интрон |
|
β-Актин (ACTB) |
F: CATGTACGTTGCTATCCAGCC |
~250 |
Кодирующая |
|
GAPDH |
F: CCTGAACGGGAAGCTCАCС R: GCAGGTTTTTCTAGACGGCAT |
~130 |
Кодирующая |
Источник: составлено авторами на основе полученных данных в ходе исследования.
Список генов, выбранных в ходе биоинформационного анализа, включал 9 локусов, сигнального пути MAPK (Grb2, SOS1, KRAS, NRAS, BRAF, MEK1, ERK2, PKA (PRKACA), PI3K (PIK3CA)). Количественная ПЦР в режиме реального времени с интеркалирующим красителем EvaGreen®Dye (Biotium, США) проводилась на термоциклере Bio-Rad CFX96.
Амплификация каждого образца осуществлялась в 3 технических повторах. При этом усредненные данные по каждому генетическому локусу нормализовались относительно усредненного показателя референсных генов: ΔC(t)=C(t)(среднее гена мишени) – C(t)(среднее геометрическое референсных генов). Копийность гена (rCN) вычисляли по формуле rC=Е-ΔC(t), где Е - эффективность реакции амплификации, рассчитанная по формуле E=10-1/h, где h - коэффициент уравнения C(t) = h•log P0 + b, полученного путем линейной аппроксимации экспериментальных данных (Е=1,98). Далее вычисляли медиану rCоп для образцов опухолевых тканей и медиану rCNн для образцов тканей доброкачественных новообразований по каждому генетическому локусу и рассчитывали кратность изменения (fold change, FC) копийности генов в опухолевых образцах по отношению к нормальным: FC = rCNопухоль/rCNне опухоль [10].
Определение соматических мутаций. Определение соматических мутаций V600E, V600К, V600R, K601E проводили методом прямого секвенирования по Сэнгеру с использованием генетического анализатора ABI Prism 3500 (Life Technologies, США). ПЦР для наработки ампликона экзона 15 гена BRAF проводилась с использованием пары праймеров F:TGCTTGCTCTGATAGGAAAATGAGA и R:AACTCAGCAGCATCTCAGGG. Амплификация проводилась по программе: 95°C - 5 мин. и 40 циклов: 95°С - 15 с, 66°С -15 с, 72°С - 20 и 72°С - 30 мин. Секвенирующая амплификация проводилась по стандартному протоколу с использованием набора ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit. Ver 3.1 по программе: 96°С - 1 мин. и 30 циклов: 96°С - 10 с, 50°С - 5 с, 72°С - 4 мин. [11].
Статистический и биоинформационный анализ данных выполняли в программах и средах программирования, включая Statistica 10.0 (StatSoft, США) и Rstudio (v4.0.1). Для проверки распределения признаков на соответствие закону нормального распределения использовали критерий Колмогорова-Смирнова. Для оценки различий значений количественных показателей применяли непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Для учета множественного сравнения использовали поправку Бонферрони [12].
Результаты исследования и их обсуждение
Проведенный биоинформационный анализ TCGA выявил изменение копийности 4500 генов у пациентов с меланомой кожи, 9 из которых (Grb2, SOS, KRAS, NRAS, BRAF, MEK1, ERK2, PKA, PI3K) были ассоциированы с эффективностью терапии ингибиторами BRAF/MEK. Прирост копий гена BRAF и MEК1 был более распространен в образцах с мутациями V600K по сравнению с V600E (p<0,001), что было подтверждено в наборе данных TCGA.
У 317 пациентов ФГБУ «НМИЦ онкологии» МЗ РФ выявлены мутации: V600E у 294, V600К – у 20, V600R – у 1, K601E - у 2 пациентов, и только у 230 из них был зафиксирован клинически значимый ответ на лечение BRAF/MEK-ингибиторами. Биологические образцы всех пациентов были проанализированы на изменение копийности генов BRAF, Grb2, KRAS, NRAS, SOS, MEK1, ERK2, PKA и PI3K. У 87 пациентов с мутацией V600E без ответа на терапию выявлено статистически значимое (p<0,001) увеличение копийности генов SOS в 4,4 раза, KRAS в 2,1 раза, BRAF в 1,9 раза, MEK1 в 2,3 раза, ERK2 в 1,9 раза и PI3K в 3,8 раза относительно доброкачественных новообразований (рис.). А также обнаружено статистически значимое (p<0,001) увеличение копийности генов SOS в 2,9 раза и PI3K в 2,2 раза у пациентов без ответа на терапию относительно группы с клинически значимым ответом.
Сигнальные пути MAPK являются эволюционно консервативными путями передачи сигнала, которые регулируют множество фундаментальных клеточных процессов, включая пролиферацию клеток, дифференциацию, старение, выживание, трансформацию и миграцию [13].
Относительная копийность генов сигнального пути MAPK в опухолевой ткани относительно ткани доброкачественных новообразований
Примечание. * - статистически значимые отличия относительно доброкачественных новообразований (p<0,001); ** - статистически значимые отличия относительно группы с клинически значимым ответом на терапию (p<0,001).
Источник: составлено авторами по результатам данного исследования.
Эти сигнальные пути характеризуются отличительной чертой линейных/векторных каскадов событий фосфорилирования, которые распространяются от клеточной мембраны к ядру. Путь MAPK активируется при взаимодействии широкого спектра внеклеточных сигналов, включая митогены, факторы роста и цитокины, со специфическими рецепторами плазматической мембраны. Это взаимодействие запускает иерархический каскад событий фосфорилирования, который в конечном итоге заканчивается активацией специфических MAP-киназ (MAPK) - их каталитическая активность определяет специфический сигнальный ответ данного пути, т. е. активацию/репрессию определенного набора генов в ядре вместе с активацией/репрессией определенных клеточных функций в цитоплазме [6]. Сигнальный путь MAPK/ERK необходим для развития и прогрессирования меланомы - мутационный ландшафт, описанный выше, показывает, что наиболее частыми движущими мутациями в меланомогенезе являются активирующие мутации этого пути; более того, реактивация сигнализации MAPK генетическими и эпигенетическими событиями является основным механизмом приобретенной устойчивости к таргетной терапии в этой опухоли [6].
В нормальных клетках млекопитающих киназы RAF (ARaf, BRaf и CRaf) являются наиболее важными эффекторами RAS [14]; дополнительными эффекторами RAS являются путь PI3K/AKT/PTEN [15] и путь Ral/RalGDS [16]. Пути PI3K и Ral часто активируются при меланоме, где они участвуют в развитии приобретенной лекарственной устойчивости, часто подрывая таргетную терапию BRAF/MEK. Более того, они в значительной степени пересекаются друг с другом и с путем MAPK [16].
В таблице 2 представлены ключевые характеристики генов сигнальных путей MAPK и PI3K/AKT/mTOR с аномальной копийностью.
Таблица 2
Характеристики генов сигнальных путей MAPK и PI3K/AKT/mTOR
|
Название |
Функция |
Роль в сигнальном пути |
|
SOS (Son of Sevenless) |
Кодирует гуанин-нуклеотид обменный фактор (GEF - Guanine nucleotide Exchange Factor) для белков семейства RAS. Связывается с Grb2 и активирует RAS, способствуя обмену GDP (неактивная форма) на GTP (активная форма) |
Непосредственный активатор RAS в ответ на стимуляцию RTK через Grb2 |
|
KRAS (Kirsten RAt Sarcoma virus oncogene homolog) |
Малая ГТФаза (G-белок) семейства RAS. В активной GTP-связанной форме взаимодействует с эффекторными белками (в первую очередь с RAF киназами), передавая сигнал дальше. Играет ключевую роль в регуляции пролиферации, дифференцировки и выживания клеток |
Ключевой переключатель сигнала от RTK/Grb2/SOS к эффекторным путям, таким как MAPK и PI3K. Часто мутирован или амплифицирован при раке |
|
BRAF (B-Raf proto-oncogene, serine/threonine kinase) |
Серин/треониновая киназа, член семейства RAF киназ. Является основным эффектором белков RAS. Активируется связыванием с RAS-GTP и последующими фосфорилированиями. Фосфорилирует и активирует MEK |
Прямой активатор MEK в каскаде MAPK. Мутация V600E является одной из самых известных в онкологии
|
|
MEK1 (MAP2K1) |
Киназа с двойственной специфичностью (фосфорилирует и серин/треонин, и тирозин). Активируется фосфорилированием со стороны RAF киназ. Фосфорилирует и активирует MAPK |
Прямой активатор MAPK (ERK) в каскаде MAPK |
|
MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) или ERK2 (MAPK1) |
Серин/треониновая киназа. Активируется фосфорилированием со стороны MEK. Фосфорилирует множество цитоплазматических и ядерных мишеней (транскрипционные факторы, другие киназы, регуляторы апоптоза, цитоскелетные белки) |
Ключевой эффекторный киназный каскад. Регулирует экспрессию генов, участвующих в пролиферации, выживании, миграции, дифференцировке клеток. Конечная киназа каскада RAS-RAF-MEK-MAPK |
|
PI3K (Phosphoinositide 3-Kinase) |
Липидная киназа. Фосфорилирует фосфатидилинозитол (4,5)-бисфосфат с образованием фосфатидилинозитол трисфосфата, который служит для рекрутирования в мембрану сигнальных белков с PH-доменами (например, AKT) |
Активирует сигнальный путь PI3K-AKT-mTOR, регулирующий пролиферацию, метаболизм и подвижность клеток. Часто мутирован или амплифицирован при раке |
Источник: составлено на основании данных, представленных в источниках [14-17].
Пути PI3K и MAPK/ERK часто активируются совместно в ответ на стимуляцию факторами роста и другими внеклеточными сигналами. Они могут взаимодействовать друг с другом на различных уровнях, усиливая или регулируя клеточный ответ. Нарушения в этих путях, в частности мутации в PIK3CA, могут приводить к развитию рака, а понимание этих взаимосвязей имеет значение для разработки новых методов лечения [17].
Заключение
В ходе проведенного исследования у больных меланомой кожи с мутацией V600E в гене BRAF и отрицательным ответом на терапию ингибиторами протеинкиназ выявлено статистически значимое (p<0,001) повышенное число копий генов BRAF, SOS, KRAS, MEK1, ERK2 и PI3K в опухолевой ткани по сравнению с этим показателем в доброкачественных новообразованиях. Соответственно, у данных пациентов, независимо от наличия или отсутствия мутаций гене BRAF, может наблюдаться активация сигнального пути RAS-RAF-MEK-ERK, опосредованная увеличением числа копий генов BRAF, SOS, KRAS, MEK1 и ERK2. Таким образом, применение BRAF/MEK-ингибиторов может быть не целесообразно у данных пациентов, так же как и у больных с повышенной копийностью гена PI3K в опухолевой ткани. Рутинное исследование CNV данных генов может позволить избежать неэффективного лечения меланомы кожи дорогостоящими препаратами.