Введение
Псориаз – хроническое иммуноассоциированное заболевание мультифакториальной природы с доминирующим значением в развитии генетических факторов, характеризующееся ускоренной пролиферацией кератиноцитов и нарушением их дифференцировки, дисбалансом между провоспалительными и противовоспалительными цитокинами, с частыми патологическими изменениями опорно-двигательного аппарата [1].
Псориаз относится к числу наиболее распространенных заболеваний кожи и, по литературным данным, встречается у 1–2 % населения различных стран. Всемирная организация здравоохранения классифицирует псориаз как одно из самых тяжелых хронических неинфекционных заболеваний. По данным официальной государственной статистики, в Российской Федерации распространенность псориаза на 2021 г. составляет 243,7 заболевания на 100 тыс. населения, заболеваемость – 59,3 на 100 тыс. населения [1].
Патогенез псориаза очень сложен и основан на межклеточном взаимодействии между кератиноцитами, лейкоцитами и другими клетками в коже [2]. При этом кератиноциты играют важную роль как на начальной фазе, ускоряя воспаление, так и на поддерживающей фазе, способствуя развитию хронического воспалительного процесса [3]. Этиология псориаза до конца не изучена, но включает в себя как генетически-обусловленные, так и ненаследственные факторы. На сегодняшний день выявлено множество локусов, связанных с предрасположенностью к псориазу, среди которых есть локус PSORS1, расположенный на хромосоме 6p21, который играет наибольшую роль в прогнозировании развития этого заболевания. К негенетическим факторам относятся солнечные ожоги, травмы, различные инфекционные заболевания, употребление алкоголя и табака, прием некоторых лекарств и ожирение [4]. Данные факторы приводят к активации окислительного стресса.
Окислительный стресс возникает вследствие повышенной продукции активных форм кислорода (АФК), активных форм азота (АФА) и/или снижения количества/активности антиоксидантов, ответственных за их нейтрализацию [5]. Хотя АФК играют роль сигнальных молекул и участвуют в регуляции биологических и физиологических процессов, окислительный стресс является причиной большого числа патологических состояний. Окислительный стресс, как состояние окислительно-восстановительного дисбаланса [6], вызывает окислительное повреждение клеточных компонентов (таких как белки, липиды и нуклеиновые кислоты), что в дальнейшем вызывает нарушение функции клеток и индукцию апоптоза [7]. Окислительный стресс является одним из ключевых и часто упускаемых из виду патогенетических механизмов при псориазе. Кожа человека является потенциальной мишенью для окислительного повреждения, поскольку она постоянно подвергается воздействию факторов окружающей среды, генерирующих АФК [8].
Цель исследования – сравнение уровня биомаркеров оксидативного стресса в пробах коронарного венозного эффлюента у крыс с преимущественно клеточным или гуморальным иммунитетом на фоне индуцированного псориаза.
Материалы и методы исследования
Настоящее исследование представляет экспериментальное исследование на животных in vivo. Все эксперименты и анализы проводились в строгом соответствии с Европейской директивой 2010/63/ЕС о благополучии лабораторных животных, Директивой Совета Европейских сообществ (86/609/EEC) и принципами надлежащей лабораторной практики.
С 2009 г. одной из самых популярных моделей для изучения псориазоподобного воспаления у мышей стало повторное местное нанесение имихимода – агониста Toll-подобного рецептора (TLR) 7/8. Эта модель имеет ряд преимуществ, главными из которых являются ее невысокая стоимость и простота использования. Для моделирования псориаза на депилированную спину или уши крыс наносили ежедневно в течение 5–7 дней 5 %-ный крем, содержащий имихимод [9].
В данной серии экспериментов использовали 48 самцов-крыс, возрастом 8 недель со средней массой тела 200±20г: 24 крысы линии Dark Agouti и 24 крысы линии Albino Oxford, которые были получены из вивария Военно-медицинской академии в Белграде. Подопытных животных содержали в соответствии с установленными условиями. Животные были предварительно акклиматизированы, для чего их помещали в клетки сроком на 7 дней с целью адаптации к новой среде. После акклиматизации животные были перемещены в полипропиленовые клетки, размером 15×30×40 см, наполненные белой сосновой стружкой, с циклом чередования света/темноты по 12 ч (началом световой фазы было 7 часов утра), температурой (22 ± 2 ºС) и относительной влажностью воздуха (45–55 %).
После адаптации к новой среде крыс разделили на четыре равные группы (по 12 животных в каждой):
1 группа – 1А – интактные крысы линии Dark Agouti – с выраженным клеточным иммунным ответом (Th1-иммунным ответом),
2 группа – 1Б – крысы линии Dark Agouti с индуцированным псориазом,
3 группа – 2А – интактные крысы линии Albino Oxford – с выраженным гуморальным иммунным ответом (Th2-иммунным ответом),
4 группа – 2Б – крысы линии Albino Oxford с индуцированным псориазом.
Для индукции псориаза использовали 5 %-ный крем имихимода. При местном применении крем вызывает дерматит, который морфологически и клинически соответствует проявлениям псориаза [9–11]. Крысам из групп с индуцированным псориазом ежедневно обрабатывали кожу 50 мг 5 %-ного крема имихимода, который в течение семи дней наносили тонким слоем на выбритую кожу спины (3см × 2,5см).
После короткой кетамин/ксилазиновой анестезии (10мг/кг – 5мг/кг) животных выводили из эксперимента путем декапитации. Изолированные сердца животных подвергали ретроградной перфузии с использованием модели ретроградной перфузии изолированного сердца Лангендорфа (аппарат Лангендорфа, Exerimetria Ltd, 1062 Будапешт, Венгрия) с соответствующим изменением коронарного перфузионного давления (КПД) 40–120см водного столба (см H2O). Функцию изолированного сердца, а также коронарную ауторегуляцию исследовали при изменении перфузионного давления, начиная со значения 60см H2O (после установления нормального сердечного ритма; КПД = 70см H2O, около 30мин), затем 80, 100, 120см H2O и в конце 40 см H2O. При каждом заданном значении КПД определяли содержание биомаркеров оксидативного стресса: супероксидного аниона радикала (О2-), перекиси водорода (Н2О2), индекса перекисного окисления липидов (ИПОЛ) и оксида азота (NO2-) в пробах коронарного венозного эффлюента.
Определение содержания О2- в пробах коронарного венозного эффлюента проводилось с использованием колориметрического метода, базирующегося на реакции О2- с нитросиним тетразолием с образованием окрашенного продукта – нитросиниевого формазана. В ходе эксперимента в пробирке смешивали 50mл исследуемого образца с 950mл осадочной смеси. Спектрофотометрическое измерение поглощения проводилось с интервалами в 60 с, трижды, при длине волны 550нм [12].
Анализ содержания H2O2 в пробах венозного эффлюента коронарных сосудов осуществлялся посредством колориметрического анализа, основанного на окислительно-восстановительной реакции. В качестве субстрата использовался феноловый красный, который окислялся перекисью водорода в присутствии конъюгированной пероксидазы хрена (HRPO) в качестве катализатора. Степень окисления, коррелирующая с концентрацией H2O2, оценивалась путем измерения оптического поглощения при длине волны 610 нм. Протокол включал приготовление реакционной смеси путем объединения 800mл раствора фенолового красного (содержащего 10мМ калий-фосфатный буфер, 0,28мМ фенолового красного, 5,5мМ D(+)-глюкозы и 140мМ NaCl) с 200mл исследуемого образца. После добавления 10мкл свежеприготовленного раствора HRPO (разведенного в соотношении 1:20) и инкубации смеси при комнатной температуре в течение 10 мин проводилось спектрофотометрическое измерение [13].
Содержание продуктов перекисного окисления липидов (ИПОЛ) в коронарном венозном эффлюенте определяли с использованием непрямого тиобарбитурового метода. Этот метод основан на химической реакции тиобарбитуровой кислоты с конечными продуктами окисления липидов. В ходе исследования в пробирку добавляли 0,8мл образца коронарного венозного эффлюента и 200mл 1 %-ного раствора тиобарбитуровой кислоты в 0,05М щелочи (NaOH). Полученную смесь подвергали термической обработке на водяной бане при 100 ºC в течение 15 мин, а затем охлаждали до комнатной температуры в течение такого же времени. Конечный продукт реакции, образующийся при взаимодействии тиобарбитуровой кислоты с продуктами окисления липидов, измеряли спектрофотометрически по поглощению света на длине волны 530нм [12–14].
Определение концентрации NO2- в коронарном венозном эффлюенте осуществлялось посредством непрямого колориметрического метода, основанного на реакции с реактивом Грисса. Данный реактив, в условиях присутствия нитрита, инициирует образование диазосоединения, характеризующегося интенсивным пурпурным цветом. Экспериментальная процедура включала следующие шаги: в пробирку помещали 1мл исследуемого венозного эффлюента, к которому добавляли 0,25мл свежеприготовленного реактива Грисса и 0,125мл аммиачного буфера. Полученную смесь подвергали инкубации на ледяной бане в течение 15 мин, после чего проводили центрифугирование при 6000об/мин на протяжении 15 мин. После отделения надосадочной фракции к осадочному компоненту добавляли 220мкл раствора карбоната калия (K2CO3). Далее, к 0,22мл полученного образца добавляли 0,25мл реактива Грисса и 0,125мл аммиачного буфера, переносили в новые стерильные пробирки Эппендорфа и оставляли примерно на 15мин при комнатной температуре. Через 15 мин оптическая плотность измерялась спектрофотометрически при длине волны 550 нм [13, 14].
Аналитический статистический анализ выполнен с использованием критерия Краскела – Уоллиса для сравнения средних значений в независимых выборках и критерий честной значимой разности, или тест Тьюки, для сравнения изменений в процентах между группами. Статистическая значимость была установлена на уровне 0,05. Статистический анализ проводился с использованием IBMSPSS версия 26.0.
Результаты исследования и их обсуждение
Уровень супероксид-анион радикала в пробах коронарного венозного эффлюента у крыс Th1- и Th2-иммунным ответом представлен в табл. 1.
Таблица 1
Уровень супероксид-анион радикала (О2-) в пробах коронарного венозного эффлюента у здоровых крыс Dark Agouti (1А), у крыс Dark Agouti с индуцированным псориазом (1Б), у здоровых крыс Albino Oxford (2А) и у крыс Albino Oxford с индуцированным псориазом (2Б)
|
Группы |
1А |
1Б |
2А |
2Б |
|||
|
КПД (см Н2О) |
О2- (нмоль/мл) в пробах коронарного венозного эффлюента |
||||||
|
40 |
20,5±3,4 |
43,6±5,6* |
8,7±0,8# |
28,3±2,5** ## |
|||
|
60 |
41,6±5,3 |
78,1±7,8* |
13,4±1,7# |
30,5±3,3** ## |
|||
|
80 |
29,4±2,9 |
61,0±6,4* |
15,3±1,8# |
40,2±4,6** ## |
|||
|
100 |
34,3±3,1 |
51,1±5,3* |
12,0±1,5# |
58,2±6,4** |
|||
|
120 |
39,4±4,5 |
59,8±6,0* |
39,3±5,1 |
58,6±6,4** |
|||
Примечание. * – р < 0,05 между 1А и 1Б группами; ** – р < 0,05 между 2А и 2Б группами; # – р < 0,05 между 1А и 2А группами; ## – р < 0,05 между 1Б и 2Б группами.
Источник: составлено авторами на основе полученных данных в ходе исследования.
Результаты показали, что уровень О2-, у крыс 1Б группы был статистически значимо больше, чем у животных 1А группы при всех значениях КПД. Одновременно у крыс 2Б группы уровень О2- был статистически значимо больше, чем у крыс 2А группы при всех значениях КПД. Сравнивая показатели уровня О2- у здоровых крыс, можно отметить, что данный показатель был статистически значимо больше у крыс Dark Agouti (Th1-иммунным ответом) по сравнению с крысами Albino Oxford (с Th2-иммунным ответом) при значениях КПД 40–100 см H2O. У крыс 1Б группы уровень О2- был статистически значимо выше, чем у крыс группы 2Б при значении КПД 40–80 см H2O.
Таким образом, у крыс 1Б группы выявлены самые высокие показатели супероксид-анион радикала, что свидетельствует о том, что Th1-иммунный ответ у них имеет более выраженный характер, чем в группе крыс Albino Oxford с Th2-иммунным ответом.
Уровень перекиси водорода в пробах коронарного венозного эффлюента у крыс Th1- и Th2-иммунным ответом представлен в табл. 2.
Таблица 2
Уровень перекиси водорода (Н2О2) в пробах коронарного венозного эффлюента у здоровых крыс Dark Agouti (1А), у крыс Dark Agouti с индуцированным псориазом (1Б), у здоровых крыс Albino Oxford (2А) и у крыс Albino Oxford с индуцированным псориазом (2Б)
|
Группы |
1А |
1Б |
2А |
2Б |
|||
|
КПД (см Н2О) |
Н2О2 (нмоль/мл) в пробах коронарного венозного эффлюента |
||||||
|
40 |
19,6±2,3 |
48,5±5,1* |
12,2±1,4# |
33,3±4,5** ## |
|||
|
60 |
21,5±2,4 |
52,1±5,8* |
14,7±1,5# |
36,6±3,8** ## |
|||
|
80 |
23,8±2,8 |
60,2±6,3* |
16,6±1,8# |
41,5±4,6** ## |
|||
|
100 |
26,4±3,0 |
56,2±5,5* |
19,0±2,0# |
55,4±6,4** |
|||
|
120 |
28,3±3,5 |
64,8±6,0* |
21,3±3,1# |
58,9±6,8** |
|||
Примечание. * – р < 0,05 между 1А и 1Б группами; ** – р < 0,05 между 2А и 2Б группами; # – р < 0,05 между 1А и 2А группами; ## – р < 0,05 между 1Б и 2Б группами.
Источник: составлено авторами на основе полученных данных в ходе исследования.
Уровень Н2О2 у крыс 1Б группы был статистически значимо больше, чем у здоровых животных 1А группы при всех значениях КПД. Одновременно у крыс 2Б группы уровень Н2О2 был статистически значимо выше, чем у здоровых крыс 2А группы при всех значениях КПД. Сравнивая показатели уровня Н2О2 у здоровых крыс, можно отметить, что данный показатель был статистически значимо выше в 1А группе, чем в 2А при всех значения КПД. У крыс 1Б группы уровень Н2О2 был статистически значимо выше, чем у крыс 2Б группы при значении КПД 40–80 см H2O.
Таким образом, у крыс 1Б группы выявлены самые высокие показатели Н2О2, что свидетельствует о том, что Th1-иммунный ответ у них более выражен при псориазе, чем у крыс группы с Th2-иммунным ответом.
Уровень ИПОЛ в пробах коронарного венозного эффлюента у крыс с Th1- и Th2-иммунным ответом представлен в табл. 3.
Таблица 3
Значения индекса перекисного окисления липидов (ИПОЛ) в пробах коронарного венозного эффлюента у здоровых крыс Dark Agouti (1А), у крыс Dark Agouti с индуцированным псориазом (1Б), у здоровых крыс Albino Oxford (2А) и у крыс Albino Oxford с индуцированным псориазом (2Б)
|
Группы |
1А |
1Б |
2А |
2Б |
|||
|
КПД (см Н2О) |
ИПОЛ (нмоль/мл) в пробах коронарного венозного эффлюента |
||||||
|
40 |
16,4±1,4 |
38,8±4,2* |
16,3±1,7 |
21,8±2,2** ## |
|||
|
60 |
26,6±2,3 |
42,8±4,8* |
15,5±1,6# |
30,7±3,0** ## |
|||
|
80 |
28,2±2,9 |
44,0±5,4* |
24,5±2,8 |
36,6±4,1** ## |
|||
|
100 |
30,7±3,1 |
46,1±5,1* |
29,0±2,5 |
38,2±4,4** |
|||
|
120 |
32,5±3,5 |
50,8±6,0* |
29,5±3,1 |
50,7±6,4** |
|||
Примечание. * – р < 0,05 между 1А и 1Б группами; ** – р < 0,05 между 2А и 2Б группами; # – р < 0,05 между 1А и 2А группами; ## – р < 0,05 между 1Б и 2Б группами.
Источник: составлено авторами на основе полученных данных в ходе исследования.
Уровень ИПОЛ у крыс 1Б группы был статистически значимо больше, чем в 1А группе при всех значениях КПД. Одновременно у крыс 2Б группы уровень ИПОЛ был статистически значимо больше, чем в 2А группе при всех значениях КПД. Сравнивая показатели уровня ИПОЛ у здоровых крыс, можно отметить, что данный показатель был статистически значимо больше у крыс 1А группы, чем в 2А при значениях КПД 60 Н2О. У крыс 1Б группы уровень ИПОЛ был статистически значимо больше, чем у крыс 2Б группы при значении КПД 40–80 см H2O.
Таким образом, у крыс Dark Agouti с Th1-иммунным ответом с индуцированном псориазом выявлены самые большие показатели ИПОЛ, что свидетельствует о том, что Th1-иммунный ответ более выражен, в сравнении с крысами Albino Oxford с Th2-иммунным ответом.
Уровень оксида азота в пробах коронарного венозного эффлюента у крыс с Th 1- и Th 2-иммунным ответом представлен в табл. 4.
Таблица 4
Уровень оксида азота (NO2-) в пробах коронарного венозного эффлюента у здоровых крыс Dark Agouti (1А), у крыс Dark Agouti с индуцированным псориазом (1Б), у здоровых крыс Albino Oxford (2А) и у крыс Albino Oxford с индуцированным псориазом (2Б)
|
Группы |
1А |
1Б |
2А |
2Б |
|||
|
КПД (см Н2О) |
NO2- (нмоль/мл) в пробах коронарного венозного эффлюента |
||||||
|
40 |
125,7±12,4 |
185,8±19,2* |
100,3±10,7 |
122,3±12,2 |
|||
|
60 |
150,6±15,3 |
182,8±18,8 |
145,5±14,6 |
150,7±15,0 |
|||
|
80 |
178,2±17,9 |
200,0±20,4 |
170,5±17,8 |
176,6±17,1 |
|||
|
100 |
190,7±19,1 |
206,1±25,1 |
190,0±19,5 |
208,2±20,4 |
|||
|
120 |
182,3±18,5 |
188,8±18,0 |
199,5±19,1 |
190,7±19,1 |
|||
Примечание. * – р < 0,05 между 1А и 1Б группами; ** – р < 0,05 между 2А и 2Б группами; # – р < 0,05 между 1А и 2А группами; ## – р < 0,05 между 1Б и 2Б группами.
Источник: составлено авторами на основе полученных данных в ходе исследования.
Уровень оксида азота у крыс 1Б группы был статистически значимо выше, чем в 1А группе при КПД 40 см Н2О. При остальных значениях КПД и в сравнительных группах статистически значимых отличий не получено.
Таким образом, на основании результатов, полученных в ходе проведения экспериментов, было доказано, что оксидативный стресс играет значимую патогенетическую роль в развитии псориаза. При этом заболевании одновременно участвуют и T-хелперные клетки 1 типа, отвечающие за клеточный иммунитет, и T-хелперные клетки 2 типа, запускающие гуморальный иммунитет.
Учитывая ранее проведенные исследования, в которых говорится, что, помимо вовлечения в патологический процесс кожи и суставов, у пациентов наблюдаются многочисленные коморбидные состояния, патогенетически взаимосвязанные с основным заболеванием, такие как воспалительные заболевания кишечника и аутоиммунные заболевания глаз, а также сердечно-сосудистые заболевания, ожирение и метаболический синдром, диабет, остеопороз, злокачественные новообразования и другие сопутствующие заболевания [15], было показано, какой именно иммунный ответ больше вовлечен в развитие данного аутоиммунного процесса. Несмотря на то, что было бы ожидаемо обнаружить превосходство T-хелперных клеток 2 типа, задействованных в гуморальном иммунитете, в генерации свободных радикалов, запускающих механизмы альтерации таргетных клеток, полученные результаты неожиданно выявили совершенно противоположный процесс.
В данном исследовании впервые было продемонстрировано, что у крыс T-клетки-хелперы 1 типа, отвечающие за клеточный иммунитет, были гораздо более активны в отношении свободнорадикальных процессов.
Также авторами впервые показано, что при псориазе в патологический процесс вовлекаются и клетки миокарда через активацию оксидативного стресса, вызванного T-хелперными лимфоцитами 1 типа.
Таким образом, проведенное исследование впервые обнаружило, что при псориазе поражение сердца опосредованно за счет активации T-хелперов 1 типа, а не вследствие T-хелперов 2 типа, как следовало ожидать.
Заключение
Результаты показали статистически значимые различия между экспериментальными животными линий Dark Agouti с Th1-иммунным ответом и Albino Oxford с Th2-иммунным ответом, а также между группами крыс с индуцированным псориазом и без него в линии Dark Agouti с Th1-иммунным ответом, в связи с чем возникает необходимость в уточнении механизма появления этих различий путем проведения дальнейших исследований.
В группе крыс линии Dark Agouti с выраженным клеточным иммунным ответом и индуцированным псориазом выявлены самые высокие показатели супероксидного аниона радикала, перекиси водорода, индекса перекисного окисления липидов, что потенциально может быть свидетельством о более выраженной альтерации тканей за счет главенствующей роли клеточного, а не гуморального иммунного ответа при развитии псориаза.
В то же время, полагаясь на полученные данные, с определенной вероятностью можно предположить, что Th1-иммунный ответ сопровождается более выраженным оксидативным стрессом в коронарном венозном эффлюенте, чем Th2-иммунный ответ.