Введение
Интоксикация организма при травмах, сопровождающихся нарушением целостности тканей и органов, лежит в основе патогенетических механизмов, приводящих к полиорганной недостаточности [1, 2]. Одним из накапливаемых в организме при таких состояниях метаболитов является лактат. Развивающийся лактатацидоз оказывает негативное влияние на функцию мышц [3, 4]. При этом могут изменяться функции и других органов и систем [5, 6]. В совокупности такие системные нарушения становятся фактором, усугубляющим течение посттравматического периода у целевых пациентов [7, 8]. Поэтому возникающая в посттравматическом периоде гиперлактатемия требует мониторинга и соответствующей патогенетической коррекции [9, 10]. В этом плане важным фактором для разработки стратегий купирования лактатацидоза может стать выявление роли мышц различных типов в генерации лактата в посттравматическом периоде [11, 12]. Данные аспекты с фундаментальных позиций изучены неполно, что обусловило цель данной работы.
Цель исследования – изучить особенности накопления лактата в скелетных мышцах разного типа после их повреждения на модели сдавливания у крыс.
Материал и методы исследования
Исследование выполнено на 36 взрослых крысах-самцах линии Вистар массой 380–400 г. Всем животным моделировали травматическое повреждение конечности путем сдавливания мягких тканей в верхней трети правой голени корнцангом в течение 60 секунд [13]. Процедуру выполняли в условиях операционной, под общим наркозом, адаптированным по массе тела (рометар 2% – 1 мг/кг; золетил 100 – 10 мг/кг). После оперативного вмешательства животных помещали в клетки по две особи. В качестве послеоперационной анальгезии использовали метамизол натрия подкожно в дозе 30 мг/кг, 2 раза в день в течение 3 суток. Уход за животными в посттравматическом периоде осуществляли ежедневно. Животные содержались на стандартном сбалансированном рационе при свободном доступе к воде.
Эвтаназию выполняли путем декапитации после предварительной премедикации (рометар 2% – 1 мг/кг; золетил 100 – 10 мг/кг) через 7, 14, 21, 28 и 90 суток после травмы. В каждый срок выводили из опыта по 6 животных. Контрольную группу составили 6 интактных крыс аналогичной массы тела. У всех животных после эвтаназии осуществляли забор передней большеберцовой (ПББМ) и камбаловидной мышц (КМ) травмированного сегмента конечности, в процессе вывода из опыта собирали кровь. Выбор указанных мышц обусловлен тем, что ПББМ относят к мышцам с преобладанием гликолитических (быстрых) волокон, КМ – с преобладанием волокон окислительного (медленного) типа [14, 15].
После забора материала один фрагмент каждой мышцы отмывали от эритроцитов в охлажденном 0,03М растворе КСl. Взвешенную измельченную ткань растирали в 0,03М растворе КСl при 5°С до получения гомогената. Затем гомогенат центрифугировали 15 мин при 14000g на ультрацентрифуге «Beckman&Coulter» (США). В одной аликвоте полученного надосадка определяли активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и ее изоферментный спектр, определяли концентрацию лактата и глюкозы. В другой аликвоте надосадка определяли скорость образования лактата при добавлении в полученный экстракт раствора глюкозы. Соотношение реагентов: 0,5мл мышечного экстракта и 0,25мл 0,03М раствора глюкозы на 0,05М калий-фосфатном буфере. Время инкубации – 60 минут при 37°С. Реакцию останавливали добавлением 1,5мл 5%-ного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Для определения исходных концентраций субстрата параллельно ставили контрольную пробу, в которую ТХУ приливали к инкубационной смеси перед добавлением субстратов. После этого в депротеинизированном субстрате определяли концентрацию лактата и по разнице с контрольной пробой рассчитывали прибыль или убыль лактата. В навеске другого фрагмента каждой мышцы определяли содержание гликогена непрямым антроновым методом. В сыворотке крови определяли концентрацию глюкозы и лактата.
Активность ЛДГ, а также концентрацию лактата и глюкозы определяли на автоматическом биохимическом анализаторе Hitachi/BM 902 (Япония), используя наборы реагентов фирмы Vital Diagnostics (Россия). Активность ЛДГ рассчитывали в единицах активности (Е) на 1 г белка, который в экстракте определяли по методу Лоури. Концентрацию лактата, глюкозы и гликогена в мышечном экстракте выражали в молях на 1 г сырой ткани. Электрофоретическое разделение ЛДГ проводили на системе Paragon (Beckman&Coulter) с использованием реактивов и пластин этой же фирмы.
Статистическую обработку вариационных рядов проводили непараметрическими методами. Нормальность распределения в выборках оценивали по критерию Шапиро–Уилка. Результаты в таблицах представлены в виде медианы, 1–3-го квартиля (Me, Q1-Q3). Статистическую значимость различий показателей оценивали с применением Т[C1]-критерия Манна–Уитни. Минимальный уровень значимости (р) принимали равным 0,05 и менее. Статистическую обработку данных выполняли в программе AtteStat версия 9.3.1.
До начала исследования было получено одобрение локального этического комитета (протокол №2(75) от 23.10.2023 г.). Исследование проведено при соблюдении принципов гуманного обращения с лабораторными животными в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей, и Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22.09.2010 г. по охране животных, используемых в научных целях.
Результаты исследования и их обсуждение
Обнаружено, что уровень лактата в ПББМ интактных животных был статистически значимо выше, чем в КМ, в среднем в 2,4 раза (р=0,01) (табл. 1). В посттравматическом периоде динамика уровня лактата в данных мышцах имела существенные различия. Так, в ПББМ концентрация лактата была существенно выше средних значений интактных животных лишь однажды – на 21-е сутки после травмы, когда уровень лактата относительно интактных животных был выше на 26% (р=0,05). В свою очередь, содержание лактата в КМ на всех сроках наблюдения после травмы значимо превышало значения интактных животных. Максимум накопления лактата в КМ приходился на 21-е сутки после травмы, превышая уровень интактных животных в среднем на 191% (р=0,001). Наблюдаемый рост образования лактата в скелетных мышцах травмированного сегмента сопровождался статистически значимым увеличением концентрации лактата в сыворотке крови, которое наблюдалось в период с 21-х по 90-е сутки посттравматического периода. Максимум гиперлактатемии приходился на 21-е сутки эксперимента (на этом же сроке максимум накопления лактата отмечен и в обеих исследуемых мышцах), уровень лактата крови на этом сроке был достоверно выше значений интактных животных – на 27% (р=0,01).
|
Таблица 1 Содержание лактата в скелетных мышцах (ммоль/г ткани) и в сыворотке крови (ммоль/л) крыс на сроках после моделирования травматического повреждения, Медиана (Q1-Q3) |
|||
|
Срок эксперимента |
ПББМ |
КМ |
Кровь |
|
Интактные животные |
39,0 (33,3–44,7) |
16,5*(12,2–23,5) |
2,08 (1,62–2,18) |
|
7-е сутки |
38,7 (35,4–39,7) |
26,80,04(25,1–34,9) |
2,13 (1,93–2,42) |
|
14-е сутки |
39,2 (38,6–40,7) |
35,70,004(34,0–37,5) |
2,10 (2,07–2,23) |
|
21-е сутки |
49,00,05(45,2–52,3) |
48,00,001(41,5–57,5) |
2,650,01(2,52–2,72) |
|
28-е сутки |
42,7 (35,0–45,7) |
33,60,01(30,0–39,5) |
2,400,01(2,37–2,48) |
|
90-е сутки |
41,0 (39,0–44,8) |
31,70,03 (28,6–37,0) |
2,390,04(2,23–2,50) |
Примечания: таблица 1 составлена авторами по результатам данного исследования; ПББМ – передняя большеберцовая мышца, КМ – камбаловидная мышца; Верхний индекс – уровень значимости различий (р) по сравнению с мышцей интактных животных. * – значимость различий с ПББМ интактных животных при р=0,01.
|
Таблица 2 Активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и уровень гликогена в скелетных мышцах крыс на сроках после моделирования травматического повреждения, Медиана; Q1-Q3 |
||||
|
Срок эксперимента |
ЛДГ, Е/г белка |
Гликоген, мг/г ткани |
||
|
ПББМ |
КМ |
ПББМ |
КМ |
|
|
Интактные животные |
6918 6353–7335 |
6849 6678–7465 |
22,27 21,82–23,25 |
17,33* 16,26–17,70 |
|
7-е сутки |
6781 6255–7012 |
63460,05 5688–6631 |
20,230,03 18,6–20,63 |
18,15 16,60–20,63 |
|
14-е сутки |
6675 6567–5739 |
63650,04 6297–6428 |
19,720,04 17,78–20,96 |
17,38 16,90–18,32 |
|
21-е сутки |
5874 5190–6934 |
6389 6128–6709 |
22,22 20,36–23,10 |
15,140,05 14,94–16,02 |
|
28-е сутки |
6524 5876–7766 |
6402 6203–6746 |
23,74 22,93–25,49 |
16,96 16,20–17,36 |
|
90-е сутки |
81570,04 8113–8259 |
6456 6260–7109 |
22,14 20,52–24,94 |
16,46 15,37–17,00 |
Примечания: таблица 2 составлена авторами по результатам данного исследования; ПББМ – передняя большеберцовая мышца, КМ – камбаловидная мышца; Верхний индекс – уровень значимости различий (р) по сравнению с мышцей интактных животных. * – значимость различий с ПББМ интактных животных при р=0,01.
Наблюдаемое существенное нарастание уровня лактата в КМ в посттравматическом периоде, вероятно, было связано с изменением активности ЛДГ, которая в КМ была достоверно снижена относительно значений интактных животных на 7-е и 14-е сутки после травмы (табл. 2). Такое снижение активности ЛДГ тормозило превращение лактата в пируват и вызывало накопление лактата. Это связано с особенностями изоферментного профиля ЛДГ в КМ, в котором повышено относительно ПББМ содержание Н-субъединиц, катализирующих именно превращение лактата в пируват (табл. 3). Поэтому после нарушения целостности мышц возможности распада лактата в КМ оказались снижены, вероятно, за счет большей чувствительности данной мышцы (как мышцы с преобладанием окислительных мышечных волокон) к недостатку кислорода. Отмеченные выше в КМ закономерности, очевидно, не наблюдались в ПББМ, в которой как в мышце с преобладающей гликолитической активностью лактатдегидрогеназная ферментная система в условиях посттравматического повреждения была более устойчива к анаэробным условиям (в изоферментном спектре ЛДГ существенно преобладают М-субъединицы).
|
Таблица 3 Изоферменты (% от общей активности) лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и соотношение субъединиц фермента (Н:М) в скелетных мышцах интактных крыс, Медиана (Q1-Q3) |
||||||
|
Мышца |
ЛДГ 1 |
ЛДГ 2 |
ЛДГ 3 |
ЛДГ 4 |
ЛДГ 5 |
Н:М |
|
ПББМ |
4,1 (3,7–4,9) |
9,1 (8,6–9,9) |
14,1 (13,4–14,8) |
30,2 (29,8–30,3) |
42,3 (41,1–43,1) |
26:74 |
|
КМ |
11,60,001 (10,7–12,0) |
12,60,01 (12,1–12,7) |
13,8 (13,5–14,1) |
26,20,02 (25,9–27,6) |
35,80,01 (35,2–36,0) |
35:650,01 |
Примечания: таблица 3 составлена авторами по результатам данного исследования; ПББМ – передняя большеберцовая мышца, КМ – камбаловидная мышца. Верхний индекс – уровень значимости различий (р) по сравнению с ПББМ интактных животных.
Содержание гликогена в ПББМ интактных животных было достоверно выше, чем в КМ, в среднем на 28% (р=0,01) (табл. 2). В посттравматический период уровень гликогена в ПББМ был значимо ниже значений интактных животных на 7-и и 14-е сутки после травмы, в среднем на 10% (р=0,04). В КМ уровень гликогена на 14-е сутки после травмы был в среднем снижен на 13% относительно значений интактных животных (р=0,05).
|
Таблица 4 Содержание глюкозы в скелетных мышцах (мкмоль/г) и в сыворотке крыс (ммоль/л) на сроках после моделирования травматического повреждения, Медиана (Q1-Q3) |
|||
|
Срок эксперимента |
ПББМ |
КМ |
Кровь |
|
Интактные животные |
8,7 (8,4–9,6) |
8,4 (8,0–8,8) |
16,6 (16,0–17,5) |
|
7-е сутки |
8,5 (6,8–10,8) |
8,2 (6,4–10,2) |
20,40,02 (19,2–26,3) |
|
14-е сутки |
8,8 (8,0–9,6) |
9,40,05 (9,0–10,1) |
17,5 (16,3–18,3) |
|
21-е сутки |
9,0 (7,8–9,3) |
9,2 (8,5–10,4) |
15,2 (13,9–16,5) |
|
28-е сутки |
9,9 (9,0–11,0) |
8,7 (8,5–9,6) |
18,0 (17,4–18,7) |
|
90-е сутки |
8,6 (8,2–8,8) |
8,3 (7,8–9,2) |
18,3 (17,6–19,4) |
Примечания: таблица 4 составлена авторами по результатам данного исследования; ПББМ – передняя большеберцовая мышца, КМ – камбаловидная мышца; Верхний индекс – уровень значимости различий (р) по сравнению с мышцей интактных животных.
Концентрация глюкозы в ПБММ относительно животных интактной группы на сроках наблюдения достоверно не отличалась (табл. 4). Уровень глюкозы в КМ на 14-е сутки после травмы был достоверно выше относительно животных интактной группы на 12% (р=0,05). Концентрация глюкозы в сыворотке крови животных опытной группы на 7-е сутки после травмы была достоверно выше значений животных интактной группы на 23% (р=0,02).
Полученные данные демонстрируют, что в посттравматическом периоде наиболее существенные изменения в генерации лактата наблюдались в КМ. В течение первых 3 недель после травмы в данной мышце значительно (почти в 3 раза) увеличивалось содержание лактата. При этом такое накопление лактата в КМ сопровождалось изменениями уровня субстратов гликолиза (глюкозы и гликогена): происходили снижение внутримышечных резервов гликогена в течение первых 3 недель посттравматического периода и рост уровня глюкозы на 14-е сутки после травмы. Наблюдаемый рост лактата и динамику изменения субстратов гликолиза можно связать со снижением активности ЛДГ в КМ, что, за счет преобладания в изоферментном спектре ЛДГ Н-субъединиц (катализируют переход лактата в пируват), приводило к снижению утилизации лактата через данный лактатдегидрогеназный механизм. Это в совокупности с нарушением кровоснабжения, а значит, и снижением оксигенации мышцы, приводило к существенному росту генерации лактата именно в КМ как мышце с преобладанием окислительных мышечных волокон, а значит, более чувствительной к недостатку кислорода.
При этом, однако, обнаружено, что, несмотря на значительное нарастание лактата в КМ в первые 2 недели после травмы, резервы для его утилизации по лактатдегидрогеназному пути в КМ были существенны. В частности, об этом говорят данные скорости убывания лактата в бесклеточном мышечном экстракте (табл. 5).
|
Таблица 5 Скорость образования/убыли (+/–) лактата (ммоль/г ткани*час) при инкубации мышечного экстракта с добавлением в среду раствора глюкозы, Медиана (Q1…Q3) |
||
|
Срок эксперимента |
ПББМ |
КМ |
|
Интактные животные |
+1,20 (+0,50…+2,40) |
+0,10 (0,00…+0,80) |
|
7-е сутки |
0,00 (–0,80…+2,45) |
–1,20 (–2,12…–0,58)0,03 |
|
14-е сутки |
+0,15 (–0,30…+0,90) |
–1,60 (–2,70…–1,10)0,02 |
|
21-е сутки |
+0,20 (–1,10…+1,00) |
+0,40 (+0,10…+1,70) |
|
28-е сутки |
–0,80 (–1,30…+0,80) |
–0,50 (–1,00…+1,10) |
|
90-е сутки |
+0,50 (0,00…+2,00) |
+0,90 (0,30…+1,80) |
Примечания: таблица 5 составлена авторами по результатам данного исследования; ПББМ – передняя большеберцовая мышца, КМ – камбаловидная мышца; Верхний индекс – уровень значимости различий (р) по сравнению с мышцей интактных животных.
Так, в экстракте из КМ на 7–14-е сутки после травмы отмечалось достоверное относительно КМ интактных животных увеличение скорости утилизации лактата при добавлении в среду глюкозы, то есть введение дополнительного количества глюкозы не вызывало накопления лактата. Это наблюдение позволяет говорить, что, помимо недостатка кислорода, важным фактором для торможения утилизации лактата в КМ в эти сроки является низкая доступность субстратов гликолиза – глюкозы и в определенной степени гликогена. Сохранение высокого уровня лактата в КМ на сроках 28–90-е сутки посттравматического периода, вероятно, обеспечивало наблюдаемую в этот период длительную гиперлактатемию.
В отличие от изменений, отмеченных в КМ, процессы генерации лактата в ПБММ были менее значительны. Вклад мышц с преобладающими гликолитическими волокнами в развитие гиперлактатемии в посттравматическом периоде, видимо, был несущественен, хотя и здесь отмечался рост лактата на 21-е сутки после травмы. Такая особенность ПББМ, вероятно, вызвана большей устойчивостью мышц данного типа к анаэробным условиям.
Заключение
Основным источником гиперлактатемии в посттравматический период после повреждения мягких тканей являются скелетные мышцы травмированного сегмента. При этом наибольший вклад в генерацию лактата вносят мышцы с преобладающим числом окислительных мышечных волокон, в частности камбаловидная мышца. Эти данные свидетельствуют о том, что стратегии купирования лактатацидоза в посттравматическом периоде после сдавливания скелетных мышц должны подразумевать восстановление оксигенации и повышение доступности глюкозы, прежде всего, для мышц с преимущественным преобладанием окислительных волокон, особенно в ранний посттравматический период.