Введение
В иммунопатогенезе острых кишечных инфекций значительная роль отводится гуморальному иммунитету, в основе действия которого находятся антитела, участвующие в блокировании и удалении из организма патогенных микроорганизмов. При контакте иммунокомпетентных клеток с патогенном инициируется продукция специфических иммуноглобулинов, экспрессия эффекторных молекул определяется регуляторными белками, уровень которых зависит от полиморфизма генов цитокинов. Так, в результате многочисленных исследований установлена ассоциация генетических вариантов в локусах цитокинов с чувствительностью к специфическим патогенам или с иммунопатологией хозяина. Аллели однонуклеотидного полиморфизма (single-nucleotide polymorphism, SNP) генов цитокинов различаются по своей иммунной активности или ответной реакции, что приводит к последующему влиянию на развитие иммунных эффекторных функций [1, 2]. Например, баланс между цитокинами, стимулирующими иммунные ответы Т-хелперов 1-го типа (Th1-типа) и Т-хелперов 2-го типа (Th2-типа), и модуляция этих ответов регуляторными Т-клетками являются основным фактором в результате ответа хозяина на инфекцию [3].
Цель исследования. Определение выраженности гуморального ответа при кишечных инфекциях и роли полиморфизма гена интерлейкина-10(IL-10)G1082A в экспрессии защитных белков.
Материалы и методы исследования
В исследовании приняли участие 108 пациентов, находившихся на лечении в Краевой клинической инфекционной больнице с острой кишечной инфекцией. Средний возраст пациентов – 28,3±11,6 года. В контрольную группу вошли 20 условно здоровых лиц, сопоставимых по возрасту (23,3±1,4 года). Отбор исследуемых осуществляли путем определения соответствия критериям включения: возраст 15–55 лет, отсутствие сопутствующих заболеваний в стадии декомпенсации, в острый период и/или в период обострения.
На основании клинико-лабораторных исследований для определения уровня иммуноглобулинов сформированы 3 группы:
- первую группу оставили 29 испытуемых с диагнозом «вирусная диарея»;
- вторая группа: 33 пациента с острой кишечной инфекцией (ОКИ) уточненной бактериальной этиологии;
- третья группа – 46 исследуемых с ОКИ неустановленной этиологии. Этиологический поиск осуществляли путем посева кала на питательные среды, исследования кала методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и серологического исследования крови: реакция непрямой гемагглютинации (РНГА), определение титра антител (АТ) в парных сыворотках. Активность гуморального звена иммунитета: секреторного иммуноглобулина A (sIgA), общего иммуноглобулина A (IgA), иммуноглобулина M (IgM), иммуноглобулина G (IgG) с подклассами G1, G2, G3, G4 – определяли путем исследования сыворотки крови, взятой с письменного согласия пациентов, с применением тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск) с последующим анализом результатов при помощи автоматического иммуноферментного анализатора «PersonalLab» (Италия). Молекулярно-генетические исследования (определение полиморфизма гена IL-10G1082A) основывались на выделении ДНК при помощи набора «ДНК-ЭКСПРЕСС-кровь» (НПФ «Литех», РФ) с дальнейшей амплификацией участка ДНК генного локуса. Структура использованных праймеров и параметры температурных циклов описаны в литературе и геномной базе данных. Формирование исследуемых групп проводилось по наличию полиморфных вариантов гена IL-10G1082A среди пациентов с ОКИ независимо от этиологического фактора. В первую группу вошли пациенты с ОКИ, носители варианта -1082GG – 50 человек, вторая группа – 42 пациента с генотипом -1082AG, третья группа – 16 пациентов с генотипом -1082AA. Статистическую обработку полученных данных осуществляли при помощи электронных программ Microsoft Excel 2010, Statistica 6.0, с определением статистической значимости различий при достигнутом уровне значимости р<0,05 с использованием критерия Манна–Уитни (U-тест). Для оценки соответствия распределений генотипов ожидаемым значениям при соблюдении равновесия Харди–Вайнберга и для сравнения распределения частот генотипов в группах использовали критерий χ-квадрат при уровне значимости р<0,05. Оценку распределения признаков проводили с помощью W-критерия Шапиро–Уилкса.
В работе с обследуемыми лицами соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki 1964, 2024 ред.)
Результаты исследования и их обсуждение
При исследовании уровня иммуноглобулинов у пациентов с ОКИ независимо от этиологического фактора определялся повышенный уровень IgМ и IgG. Высокий уровень IgМ является первичной реакцией макроорганизма на проникновение патогена в желудочно-кишечный тракт (ЖКТ). Кишечные патогены: бактерии, вирусы, преодолевая первичные защитные барьеры, инвазируют слизистую оболочку кишечника и способствуют формированию очага воспаления, инициируя синтез белков гуморального иммунитета, в первую очередь IgМ как молекул быстрого, но кратковременного эффекта. В дальнейшем, под влиянием Т-клеток и цитокинов В-клетки переключаются на продукцию IgG. При этом концентрация IgG значительно превышает уровень IgМ, являясь основным фактором гуморального звена и способствуя длительной иммунной защите от повторного заболевания. IgG имеют четыре подкласса: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 [4, 5], все они принимают активное участие в антибактериальной защите; к противовирусным антителам относятся преимущественно IgG1 и IgG3. При оценке экспрессии различных подклассов G установлен низкий уровень подклассов IgG1 и IgG4, с наименьшими показателями у пациентов с бактериальными диареями. При этом отмечено повышение IgG2 во всех исследуемых группах в 2–3 раза (р<0,05). IgG1, IgG3 играют ведущую роль в формировании противовирусных и антибактериальных антител. Недостаточный уровень данных подклассов может способствовать не только развитию кишечной инфекции, но и повторным случаям заболеваний в коротком промежутке времени. При попадании кишечных патогенов в желудочно-кишечный тракт клетки слизистой оболочки реагируют на действие токсинов экспрессией защитных факторов, в первую очередь Ig А. У всех групп пациентов, как с вирусной, так и бактериальной диареей, отмечалась гиперпродукция sIgA в 9 раз и общего IgA в 2,5 раза в сравнении с группой контроля (р<0,01) (табл. 1).
Таблица 1
Уровень иммуноглобулинов при острой кишечной инфекции
|
Ig, пг/мл |
Вирусные диареи (n=29) |
Бактериальные уточненные диареи (n=33) |
ОКИ неуточненной этиологии (n=46) |
Группа контроля (n=20) |
|
Ig G |
45,7 [31,85–61,08] p*<0,01 p**<0,01 |
47,38 [43,62–61,8] p*<0,01
|
47,82 [33,46–61] p*<0,01
|
16,482 [12,785–22,175] |
|
IgG1 |
2,811 [1,485–4,792] p*<0,05 p**>0,05 |
1,796 [0,988–4,247] p*<0,01
|
2,384 [0,789–4,674] p*<0,01
|
6,206 [3,83–10,825] |
|
IgG2 |
4,588 [0,350–17,212] p*<0,05 p**>0,05 |
5,35 [0,429–16,379] p*<0,05
|
2,628 [0,345–16,384] p*<0,05
|
1,968 [1,554–2,713] |
|
IgG3 |
0,948 [0,484–1,307] p*>0,05 p**>0,05 |
1,092 [0,367–2,419] p*>0,05
|
0,944 [0,461–1,538] p*>0,05
|
1,416 [1,085–1,85] |
|
IgG4 |
0,383 [0,164-0,601] p*<0,01 p**>0,05 |
0,344 [0,08-0,691] p*<0,01
|
0,381 [0,146-0,661] p*<0,01
|
1,298 [0,714-1,755] |
|
IgM |
4,706 [2,636–6,811] p*<0,05 p**>0,05 |
4,364 [3,17–6,421] p*<0,05
|
4,668 [2,75–6,914] p*<0,05
|
3,069 [2,504–3,91] |
|
IgA |
5,186 [2,926–8,076] p*<0,01 p**>0,05 |
5,882 [3,438–9,493] p*<0,01
|
5,15 [3,032–8,4] p*<0,01
|
2,355 [1,674–2,765] |
|
sIgA |
26,22 [21,295–33,285] p*<0,01 p**>0,05 |
26,46 [21,83–36,64] p*<0,01
|
26,46 [22,56–34,52] p*<0,01
|
3,04 [2,409–3,58] |
ОКИПримечание. p* – уровень статистической значимости в сравнении с группой контроля; p** – уровень статистической значимости в сравнении вирусных диарей с ОКИ бактериальной природы.
Высокая концентрация sIgA связана с повреждающим действием кишечных патогенов на слизистую оболочку. Именно sIgA, согласно литературным данным, является основным источником гуморального иммунитета слизистых оболочек и играет важную роль в качестве первой линии защиты путем инактивации патогенов на данных поверхностях [6, 7, 8]. У пациентов с легким течением заболевания концентрация IgG, IgA, sIgA была статистически значимо выше, чем у больных со среднетяжелыми формами острой кишечной инфекции. При легком течении концентрация IgG составила 48,94 [33,565–61,69] пг/мл, IgА – 5,236 [3,076–8,616] пг/мл, sIgA – 26,46 [22,56–34,95] пг/мл, в то время как при средней степени показатели IgG, IgА и sIgA были в пределах 45,7 [3288–60,85] пг/мл, 5,186 [2,926–7,947] пг/мл, 26,22 [21,295–33,285] пг/мл (р<0,05). На основе полученных результатов установлено, что кишечные патогены независимо от этиологии, оказывая повреждающее действие на клетки кишечника, запускают иммунный каскад с итоговым повышением уровня эффекторных белков в сравнении с группой контроля.
Но необходимо отметить, что продукция данных эффекторных молекул имеет непосредственную зависимость от цитокинов, в первую очередь от IL-10 [9]. IL-10 индуцирует выработку иммуноглобулинов, а уровень экспрессии зависит от полиморфизма генов [10]. Полиморфизм промоторных участков гена IL-10 обусловливает межиндивидуальную вариабельность по степени продукции IL-10 при антигенной стимуляции и формировании воспалительных клеточных реакций [11]. Так, аллель G локуса G1082А гена IL-10, являясь доминантным, индуцирует продукцию соответствующих белков, в то время как аллель А в данной паре является минорным. Таким образом, опираясь на полученные результаты, все пациенты с кишечной инфекцией независимо от этиологического фактора были распределены в три группы по признаку носительства полиморфного варианта гена IL-10 G1082A. У пациентов с кишечной инфекцией – носителей гетерозиготного варианта -1082GA установлены более высокий уровень IgG подкласса G1 – до 2,506 [0,9–4,71] пг/мл – и гипопродукция G3 (0,944 [0,464–1,538] пг/мл) (р<0,05). У обладателей рецессивного аллеля А в гомозиготном варианте -1082АА отмечены наиболее высокая концентрация IgM (4,668 [2,835–6,917] пг/мл, р<0,05) и статистически не значимое преимущество sIgA (табл. 2). При этом среди подклассов IgG дефицит подкласса G3 повышает риск развития инфекционных поражений ЖКТ [12].
Таблица 2
Уровень иммуноглобулинов при полиморфизме гена IL-10 G1082А
|
Ig, пг/мл |
Генотип GG (n=50) |
Генотип GА (n=42) |
Генотип АА (n=16) |
|
IgG |
42,84 [29,48–59,88] |
42,46 [29,01–57,605] р>0,05 |
45,64 [30,9–60,46] р>0,05 |
|
IgG1 |
2,214 [1,011–4,674] |
2,506 [0,9–4,71] р<0,01 |
2,262 [1,193–4,674] р>0,05 |
|
IgG2 |
2,771 [0,352–16,707] |
2,914 [0,342–16,845] р>0,05 |
2,268 [0,352–16,197] р>0,05 |
|
IgG3 |
0,948 [0,467–1,538] |
0,944 [0,464–1,538] р<0,05 |
0,952 [0,47–1,538] р>0,05 |
|
IgG4 |
0,383 [0,155–0,7] |
0,38 [0,148–0,63] р>0,05 |
0,384 [0,154–0,7] р>0,05 |
|
IgM |
4,606 [2,75–6,776] |
4,515 [2,564–6,622] р>0,05 |
4,668 [2,835–6,917] р<0,05 |
|
IgA |
5,15 [3,032–7,896] |
5,114 [2,81–7,869] р>0,05 |
5,078 [3,121–7,954] р>0,05 |
|
sIgA |
25,74 [18,51–30,86] |
25,24 [15,493–30,735] р>0,05 |
26,22 [20,73–32,56] р>0,05 |
ГенотипПримечание. p* – уровень статистической значимости в сравнении с нормозиготным вариантом –1082GG IL-10
При анализе клинической картины заболевания в зависимости от полиморфизма гена установлено, что среди носителей доминантного аллеля G острая кишечная инфекция независимо от нозологии протекала преимущественно в среднетяжелой форме. Длительность течения инфекционного процесса варьировала в пределах 10,2±3,3 койко-дня (-1082GA) – 10,1±3,3 койко-дня (-1082GG) в сравнении с носителями варианта -1082АА (7,7±1,3 койко-дня). Заболевание в вариабельных по аллелю G группах протекало с более выраженным симптомокомплексом, в отдельных случаях – с развитием синдрома обезвоживания. Это может быть связано с условно более низкой экспрессией общих иммуноглобулинов и в первую очередь – со статистически значимым низким уровнем IgM, в то время как у исследуемых с генотипом -1082АА отмечены наиболее высокие показатели IgM, sIgA, IgG, что способствовало легкому течению инфекционного процесса с коротким периодом заболевания. Следовательно, полиморфизм гена IL-10 G1082А определяет индукцию экспрессии иммуноглобулинов, что повышает риск заболевания и отражается на длительности и тяжести течения острых кишечных инфекций.
Заключение. При острых кишечных инфекциях независимо от этиологического фактора отмечено повышение общих белков гуморального иммунитета с наиболее высоким уровнем при легком течении заболевания. Однонуклеотидный полиморфизм гена ИЛ-10 в промоторной зоне локуса G1082А оказывает непосредственное влияние на экспрессию эффекторных молекул гуморального иммунитета, что опосредованно определяет клиническую картину и сроки болезни.