Введение. Создание математических моделей с использованием факторного анализа [1, 2] позволяет выявить скрытые связи изучаемых переменных и оценить степень их взаимного влияния. Структурная организация щитовидной железы (ЩЖ) характеризуется гистотопографическими особенностями взаимоотношений функционального (фолликулы) и регуляторного (С-тироциты, тучные клетки) звеньев [3, с. 1–38], связана с эмбриогенезом органа [4] и проявляется в срочной и долговременной адаптации к воздействию внешних факторов – сезонов года, гелиогеомагнитной активности, мышечной деятельности [5].
В настоящем исследовании приведены данные о степени влияния экзогенных (ненормируемых и нормируемых) и эндогенных (на уровне структурно-функциональных единиц органа) факторов при продолжительных нагрузках у тренированных и нетренированных собак.
Цель исследования. Используя факторный анализ, оценить степень влияния внешних факторов и индивидуальных гистотопографических особенностей на структурную организацию щитовидной железы в естественных условиях и при длительном беге.
Материалы и методы исследования. Контрольную группу представляли 16 беспородных половозрелых собак-самцов, подобранных по возрасту (1,5–2,5 года) и массе (15,7±2,8 кг). Животных со средней частотой сердечных сокращений (ЧСС) 125±6,9 уд/мин содержали в условиях вивария со стандартным рационом питания сроком не менее одного месяца при среднесуточной температуре от –18,2оС до 20,1оС, с продолжительностью светового от 7 часов 03 мин до 17 часов 42 мин, при солнечной активности (число Вольфа) от 0 до 78, планетарном (магнитном) Kp-индексе от 3 до 33 нТл. Экспериментальное воздействие (бег на ленте тредмила со скоростью 15 км/час при динамическом контроле ЧСС) проводилось как однократно – группа 1 с предельными (бег «до отказа») нагрузками на организм (n=14), так и многократно после четырех циклов индивидуально дозируемых двигательных нагрузок (ИДДН), каждый из которых состоял из тренирующих (первый этап) и стартовых (второй этап) тренировок – группа 2 (n=11). В группе 1 эксперимент проходил на фоне различных сезонных и гелиогеомагнитных воздействий: среднесуточная температура от –18,2оС до 20,0оС, продолжительность светового дня от 6 часов 49 мин до 17 часов 43 мин, при показателях солнечной активности от 0 до 133 и геомагнитной активности от 3 до 30 (нТл), время бега составило 73,1±15,0 мин при ЧСС 179±8,5 уд/мин. В группе 2 общее количество нагрузок было 70,5±2,5, среднее время бега в последнем цикле 71,3±2,56 мин при средней ЧСС 173,6±2,6 уд/мин (среднее время бега при стартовых нагрузках составляло 9,9±0,3 мин, ЧСС 183,3±2,6 уд/мин). Так как продолжительность воздействий составляла от 56 до 82 тренировок, сезонные влияния включали широкий диапазон среднесуточного значения температуры – от –10,3оС до 10,9оС, продолжительности светового дня – от 09 часов 26 минут до 17 часов 07 минут, среднего значения показателей солнечной активности – от 13 до 188 и геомагнитной активности – от 10 до 47 (нТл).
Эксперименты над животными проводились в соответствии с Директивой Европейского парламента и Совета Европейского Союза 2010/63/ЕС от 22.09.2010 г. о защите животных, использующихся для научных целей, с Федеральным законом от 27.12.2018 г. № 498-ФЗ (ред. от 27.12.2019) «Об ответственном обращении с животными и о внесении изменений в отдельные законодательные акты Российской Федерации», а также с учетом рекомендаций этического комитета от 21.12.2018 г. №313.
Исследования проводились на архивном материале.
Взятие материала осуществляли под внутривенным наркозом («золетил 50» в дозе 5 мг на 1 кг массы животного, с премедикацией 2%-ным ромитаром внутримышечно в дозе 0,2 мл на 1 кг массы животного) и управляемым внешним дыханием в стандартное время суток – 10–12 часов.
Анализу подвергались поперечные срезы парафин-целлоидиновых блоков (фиксатор 10%-ный нейтральный формалин) средней части правой доли ЩЖ толщиной 3 мкм, изготовленные с помощью роторного микротома (ERM-230L) и окрашенные различными методами (гематоксилин-эозином, азур-эозином для маркировки тучных клеток), в том числе иммуногистохимическими (С-тироциты, фибронектин, PCNA, тиреоглобулин (ТГ), фибронектин, фактор Виллебранда). Захват кадров (микроскоп «Lеika DMLS», камера «ССВ Camera DIGITAL Kocom», ув. 400) проводился в центральной, промежуточной и периферической зонах железы относительно ее геометрического центра [5]. Ряд показателей анализировали на всей поверхности среза (общее увеличение 600). Измерения морфологических параметров осуществляли в программе ImageJ после геометрической и фотометрической калибровки.
Изучаемые показатели представлены переменными: экзогенными ненормируемыми – сезонность1: продолжительность светового дня (мин), среднесуточная температура (оС), число (Вольфа) солнечных пятен (R), планетарный Kp-индекс геомагнитной активности (нТл), экзогенными нормируемыми – время бега2 (мин): для группы 2 после 4 циклов ИДДН исследовался его прирост по отношению к 1-му циклу (∆ времени бега); тренировки3 – количество тренировок первого и второго этапа; эндогенными организменными – средняя ЧСС (уд/мин) во время бега, включая ее динамику в отношении к 1-му циклу ИДДН – ∆ЧСС4, ее изменения в циклах тренировок группы 2 – степень монотонности динамики (СМД), уровень трийодтиронина (Т3) в периферической крови (пмоль/л) – в отношении групп 1 и 2 анализировалось изменение Т3 к исходным значениям (∆Т35), вес животного (кг), масса щитовидной железы (мг); эндогенными органными – средняя площадь6 (мкм2) фолликулов, коллоида, эпителия (кроме группы 1, где площадь эпителия – отдельная переменная), площадь (мкм2) фибронектин-позитивной реакции, площадь реакции фактора фон Виллебранда7 относительно площади стенки сосуда, индекс секреторной (ИСА) и пролиферативной активности (ИПА) – отношение тиреоглобулин- и PCNA-позитивных клеток к общему числу изученных клеток; резорбционные вакуоли8 – отношение их количества к количеству тиреоглобулин-секретирующих клеток, высота фолликулярного эпителия (ВФЭ, мкм); общее количество (ед.), площадь (мкм2), интегрированная средняя оптическая плотность (усл. ед.) тучных клеток (мастоцитов, ТК, регуляторов-ТК9) и С-тироцитов (С-клеток, парафолликулярных клеток, регуляторов-СТ10), включая единичные клетки (Ед.) и их группы (Гр.). Руководствуясь рекомендациями [6, с. 302-364; 7, с. 247-263] программы Statistica Ultimate Academic 13 for Windows Ru сетевая версия серийный номер: JPZ009K288811CNETACD-V «Лицензия ФГБОУ ВО "ПИМУ" Минздрава России», проводили факторный анализ. Поскольку корреляционные матрицы экспериментальных данных оказались сингулярны и вследствие вырожденности не могли быть обращены, для выделения главных факторов использовали метод итеративной общности (MINRES), предложенный Harman и Jones (1966) [8]. Редукцию количества первично выделенных общих факторов проводили, опираясь на критерий «каменистой осыпи» Р. Кеттелла и метод отбора главных компонент по правилу Кайзера (значения объясненной дисперсии больше 1), до 7 или 8, что позволяет объяснить от 79,89 до 84,84% суммарной дисперсии модели [8, 9]. Методом вращения факторов был выбран «Varimax raw» исходных значений [9, 10], значимыми считали нагрузки, превышающие или равные 0,5. «Моделирование структурными уравнениями» (SEPATH) использовали для оценки взаимоотношений между отдельными переменными. Для поиска скрытых (латентных) корреляционных связей между группами переменных использовали канонический анализ. При проведении указанных исследований в качестве статистических изучались такие показатели, как суммарная доля дисперсии главных факторов в модели, доля дисперсии признака в факторе, доля, объясняемая фактором во всей дисперсии математической модели, и коэффициенты корреляции признаков с каноническими корнями. Уровень значимости составлял р<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение. Для группы Контроль (n=16) математическая модель включала 79,89% дисперсии 25 анализируемых признаков, объединенных в семь факторов (табл. 1), и учитывала сезонные влияния, солнечную и геомагнитную активность. Ведущей переменной фактора 1 (17,51% дисперсии в модели) являлось состояние функциональных единиц – фолликулов – в конкретных сезонных условиях (фактор 3) при зафиксированной солнечной активности (фактор 7). Второй фактор (14,16% модели) включал особенности организации С-тироцитов ЩЖ, их общее количество, характер распределения (единично расположенные и группы клеток), эти переменные линейно взаимосвязаны у всех исследуемых животных. Они отражают индивидуальные структурные особенности развития и организации ЩЖ и могут быть обозначены как «показатель количества С-клеток». Паракринные влияния ТК (фактор 4) превалируют над воздействием СТ (фактор 5). Отражением состояния функциональной активности органа в условиях покоя (Контроль) может служить соотношение процессов резорбции и синтеза ТГ – ведущая переменная фактора 6 (8,72%). Выявлена взаимосвязь сезонов и площади эпителия (преимущественно), коллоида и фолликулов. Влияние гелиогеомагнитной активности на площадь эпителия и коллоида опосредовано связями с площадью и оптической плотностью гранул ТК. «Показатель количества С-клеток» связан с их морфофункциональным состоянием и массометрическими переменными. В контроле для каждого из регуляторов обнаружена связь площади сечения и степени грануляции отдельно для С-клеток и ТК, находящихся в одном факторе. Канонический корреляционный анализ не выявил связей локальных гуморальных регуляторов с морфологическими показателями функциональной активности ЩЖ. Структурное моделирование показало влияние количества ТК на площадь и степень грануляции кальцитониноцитов, а показателя количества С-клеток – на площадь эпителия и коллоида фолликулов. Статистически значимые связи между переменными внутри факторов (1 и 6) и сторонними переменными, не входящими в фактор, немногочисленны (14 связей) и обусловлены только сезонными и гелиогеомагнитными влияниями.
Таблица 1
Факторы, их участие в математической модели и переменные, их формирующие
|
Факторы |
Контроль |
Группа 1 |
Группа 2 |
|||
|
|
# |
Переменная, доля в факторе (%) |
# |
Переменная, доля в факторе (%) |
# |
Переменная, доля в факторе (%) |
|
Фактор 1 |
17,51 |
Фолликулы6, 54 (19+18+16) Количество Тучных Клеток, 12 Масса животного, 6 |
13,88 |
Сезонность1, 42 (24+18) ∆Т35, 12 Масса животного, 11 Планетарный Kp-индекс, 9 |
20,65 |
Регуляторы-ТК9, 20 (10+10) Время бега2, 11 ∆ времени бега, 10 ∆Т3, 10 ∆ЧСС4 (см. Фактор 4), ИСА, 6 ИПА (PCNA), 10 Число солнечных пятен, 5 |
|
Фактор 2 |
14,16 |
Ед. и Гр. С-тироцитов, 38 (17+21) Количество С-тироцитов, 12 Масса ЩЖ, 9 Т3 (см. Фактор 5), 7 |
13,27 |
Регуляторы-СТ10, 41 (23+19) Регуляторы-ТК, 31 (20+11) ВФЭ (см. Фактор 5), 9 |
15,52 |
Фолликулы, 42 (16+15+11) ВФЭ, 10 Средняя ЧСС при беге, 10 СМД ЧСС (см. Фактор 6), 8 |
|
Фактор 3 |
13,71 |
Сезонность, 42 (22+20) ИПА (PCNA), 17 Средняя ЧСС, 14 ВФЭ, 12 |
12,57 |
Фолликулы«-», 43 (22+21) Площадь фибронектина, 16 Масса ЩЖ (см. Фактор 7), 9 ИСА (см. Фактор 8), 8 |
13,74 |
Ед. и Гр. С-тироцитов, 35 (19+16) Количество С-тироцитов, 19 Количество ТК, 6 |
|
Фактор 4 |
10,66 |
Регуляторы–ТК, 53 (26+27) ИСА, 11 |
12,31 |
Ед. и Гр. С-тироцитов, 52 (28+24) Количество С-тироцитов, 28 |
11,60 |
Тренировки3, 40 (24+16) Сезонность, 28 (17+11) ∆ЧСС (см. Фактор 1), 8 |
|
Фактор 5 |
9,07 |
Регуляторы–СТ, 45 (17+28) Фактор Виллебранда7, 21 Т3 (см. Фактор 2), 11 |
11,28 |
Количество Тучных Клеток, 25 Средняя ЧСС при беге, 21 Площадь эпителия фолликулов, 17 ВФЭ (см. Фактор 2), 10 |
10,61 |
Регуляторы-СТ, 45 (23+22) Масса животного, 19 |
|
Фактор 6 |
8,72 |
Резорбционные вакуоли8, 33 Планетарный Kp-индекс, 14 |
9,08 |
Время бега, 34 Фактор Виллебранда, 23 ИПА (PCNA), 16 |
7,96 |
Площадь фибронектина, 34 СМД ЧСС (см. Фактор 2), 23 Количество Тучных Клеток, 10 |
|
Фактор 7 |
6,06 |
Число солнечных пятен, 38 Площадь фибронектина, 26 |
6,06 |
Резорбционные вакуоли, 42 Масса ЩЖ (см. Фактор 3), 14 |
7,77 |
Фактор Виллебранда, 34 Масса ЩЖ, 19 |
|
Фактор 8 |
|
|
5,02 |
Число солнечных пятен, 22 ИСА (см. Фактор 3), 20 |
|
|
Примечание: состав групп переменных приведен в разделе «Материалы и методы», + – сумма значений долей отдельных переменных в факторе (%), # – доля, объясняемая фактором во всей дисперсии математической модели.
Для группы 1 (n=14) с максимальной продолжительностью бега при однократном взаимодействии математическая модель представлена восемью факторами (табл. 1), которые характеризуют 84,41% дисперсии 26 анализируемых переменных. Ведущей переменной фактора 1 (13,88%) является влияние сезонов, которые связаны с магнитным Kp-индексом, массой животного и уровнем гормонов. Вторым фактором (13,27% влияния) служит состояние С-тироцитов и ТК как со стороны морфологических показателей (средняя площадь сечения), так и со стороны функционального состояния (оптическая плотность гранул). Функциональное напряжение при беге «до отказа» объединяет их в общий фактор, в отличие от группы Контроль. Площадь фолликулов и площадь коллоида формируют ведущую переменную третьего фактора (12,57%). Уменьшение площади фолликулов связано с уменьшением массы железы, а меньшая площадь коллоида – с меньшей площадью фибронектина как компонента стромы. Отметим, что более медленно реагирующий показатель состояния фолликулов – площадь эпителия – находится в факторе 5, совместно с общим количеством ТК. Для фактора 5 (11,28%) характерна связь ЧСС в процессе бега и площади эпителия, количества ТК, ВФЭ. «Показатель количества С-клеток», отражающий особенности индивидуальной структурной организации ЩЖ, формирует отдельный фактор 4 (12,31%) с долей влияния этих переменных (единичных клеток, их групп) 80%. Ведущей переменной фактора 6 (9,08%) в условиях предельных однократных нагрузок является время бега, связанное как с уровнем пролиферативной активности (признак долговременной адаптации), так и с состоянием эндотелия сосудистой стенки (признак срочных адаптационных изменений). Таким образом, время бега не является уникальной (изолированной) переменной, формирующей отдельный фактор. Фактор 7 (7,01%) включал взаимозависимые переменные – относительное количество резорбционных вакуолей и массу железы. Для данной экспериментальной группы характерно влияние сезонов (продолжительности светового дня и среднесуточной температуры) на снижение массы животного и ЩЖ. Для группы 1 по сравнению с Контролем характерен самый большой диапазон числа солнечных пятен (от 0 до 133), наряду с наличием связи сeзонных и гелиогеомагнитных показателей выделяется восьмой фактор (5,02% влияния), включающий солнечную и секреторную активность. В этой группе можно отметить небольшое увеличение (до 20) значимых линейных корреляционных связей с другими переменными, не входящими в данный фактор в этой группе. Для регуляторов-СТ и -ТК характерно формирование зависимости морфометрических и функциональных показателей преимущественно за счет гранул ТК. Выявлена зависимость степени дегрануляции С-тироцитов и ТК от увеличения ВФЭ. Площади коллоида и эпителия фолликулов связаны с проницаемостью сосудистой стенки (позитивная реакция фактора Виллебранда в сосуде) и функциональным состоянием (средней оптической плотностью) ТК, что демонстрирует срочные адаптационные изменения. Наряду с этим выявлена зависимость состояния фолликулов и пролиферативной активности – признаки долговременной адаптации.
Для группы 2 (n=11) с продолжительностью воздействий от 56 до 82 тренировок была предложена семифакторная модель (табл. 1), характеризующая 87,84% дисперсии 31 признака. В факторе 1 (20,65%) наряду с 37% влияния параметров эксперимента (4 из 8 переменных) ведущими переменными являются средняя площадь сечения и оптическая плотность гранул ТК, таким образом, доля воздействия регуляторов-ТК составила 20%. Показатели эксперимента (продолжительность времени бега, его прирост и динамика ЧСС по отношению к 1-му циклу ИДДН, изменения уровня Т3) формируют сложные связи с показателями секреторной (рост ИСА) и пролиферативной активности (рост ИПА), состоянием ТК (уменьшение средней площади сечения и оптической плотности гранул) и происходит на фоне увеличения солнечной активности (среднего количества солнечных пятен). В факторе 2 (влияние на 15,52% модели) ведущие переменные отражают состояние функциональных единиц ЩЖ (средняя площадь фолликулов, коллоида, эпителия). ЧСС для этой группы, ее динамика, ВФЭ (как маркер функционального напряжения тироцитов) связаны с площадью фолликулов, коллоида и эпителия в них. Фактор 3 (13,74%) формирует «показатель количества С-клеток» со степенью влияния 54%, и, если для группы 1 это изолированный фактор, то для группы 2 характерно наличие в данном факторе и другого локального гуморального регулятора (кроме того, общее количество ТК связано с С-тироцитами). Ведущей переменной в четвертом факторе (11,60%) является общее количество тренировок (40% влияния). Сeзонные переменные (28% влияния), в первую очередь увеличение среднесуточной температуры и изменения ЧСС (по отношению к 1-му циклу тренировок), связаны с уменьшением как общего числа, так и количества тренирующих нагрузок 1-го этапа. Пятый фактор (10,61%) – морфофункциональное состояние регуляторов-СТ (средняя площадь сечения и оптическая плотность гранул), обеспечивающих 45% влияния. Ведущей переменной шестого фактора (7,96% модели) является площадь фибронектина (26%) – субстрата для пролиферации тироцитов при мышечных нагрузках, седьмого фактора (7,77%) – отношение количества резорбционных вакуолей к количеству тиреоглобулин-секретирующих клеток (34% влияния), что отражает интенсивность синтеза и выведения гормонов. Каноническим анализом выявлена связь морфофункционального состояния фолликулов с ИПА (PCNA), что может служить одним из признаков долговременной адаптации. Увеличение времени бега, его прирост по отношению к 1-му циклу тренировок и среднесуточная температура взаимосвязаны, как и показатели ЧСС (СМД, средние и максимальные значения). Состояние регуляторов-ТК (средняя площадь сечения и оптическая плотность гранул) положительно связано с общим числом (от 56 до 82) и количеством тренирующих нагрузок. Структурным моделированием выявлено влияние сезонов на площадь эпителия и коллоида фолликулов, а гелиогеомагнитной активности – на площадь коллоида. Между регуляторами-СТ и -ТК формируется сложная система взаимного влияния количества, средней площади сечения клеток и оптической плотности. Подобная связь сходна по структуре с группой Контроль. Количество ТК и «показатель количества С-клеток» оказывают влияние на площадь эпителия и коллоида фолликулов. Среди 55 статистически значимых (максимальное количество для всех групп) линейных корреляционных связей с другими переменными, не входящими в данный фактор, канонический корреляционный анализ показал, что снижение гелиогеомагнитной активности сопровождается уменьшением «количественного показателя С-клеток» и дегрануляцией регуляторов-СТ и -ТК.
Заключение. Исследования показали, что факторная модель структурной организации ЩЖ в группе Контроль (n=16) представлена семью факторами. Для группы характерен широкий спектр сезонных влияний (среднесуточной температуры, продолжительности светового дня), солнечной и геомагнитной активности, которые оказывают значимое влияние на состояние функциональных единиц органа – фолликулов. В структурной организации ЩЖ в этой группе паракринные влияния ТК превалируют над воздействием С-тироцитов. Выявлено прямое воздействие сезонов и опосредованное (через морфофункциональное состояние ТК) – гелиогеомагнитной активности на площадь эпителия и коллоида. Обнаружена связь переменных (площади сечения и степени грануляции) отдельно для С-клеток и ТК, находящихся в разных факторах – 4 и 5. Отмечено влияние количества ТК на площадь и степень грануляции кальцитониноцитов, а «показателя количества С-клеток» – на площадь эпителия и коллоида фолликулов. Отражением состояния функциональной активности органа в условиях покоя (Контроль) может служить соотношение процессов резорбции и синтеза ТГ – ведущая переменная фактора 6.
Предельные нагрузки и большой диапазон солнечной активности (от 0 до 133) приводят к выделению в факторной модели структурной организации ЩЖ в группе 1 (n=14), в отличие от других групп восьмого фактора. При «беге до отказа» признаки, характеризующие функциональные единицы: площадь фолликулов, коллоида и площадь эпителия, разобщены и находятся в разных факторах. По степени воздействия по отношению к Контролю в группе более значимой является сезонная активность, а влияние С-тироцитов превалирует над влиянием ТК. Выявлена большая значимость гелиогеомагнитной активности по сравнению с организменными – массометрическими показателями. Следует отметить роль гуморальных регуляторов: ведущие переменные трех из восьми факторов формируют регуляторы-СТ и -ТК, они расположены во втором по значимости факторе и действуют содружественно, при этом «показатель количества С-клеток» формирует отдельный, изолированный фактор 4, характеризующий индивидуальные особенности развития и структурной организации органа.
Факторная модель структурной организации ЩЖ в группе 2 с длительным бегом (n=11) включает семь факторов. Показатели эксперимента для группы 2 превалируют над другими переменными: 4 из 8 переменных ведущего фактора 1, ведущая переменная (Тренировки) и динамики изменения ЧСС фактора 4. По степени значимости впервые вслед за состоянием функциональных единиц – фолликулов – выступает количество Тренировок, а влияние Сезонов демонстрирует самые низкие значения среди всех исследуемых групп. Несмотря на наличие в первом факторе регуляторов-ТК (20% влияния), в общем воздействии на модель более значимы регуляторы-СТ (отражающие индивидуальные особенности развития и строения органа), количественный показатель С-клеток дополняется в факторе 3 тучными клетками. Состояние сердечно-сосудистой системы (ЧСС и ее динамика) превалирует над гелиогеомагнитной активностью (планетарный Kp-индекс при этом не входит ни в один фактор), а массометрические показатели распределены по факторам и связаны с процессами резорбции коллоида и состоянием регуляторного звена. Высокая гелиоактивность сопровождается признаками срочной (ИСА) и долговременной (ИПА) адаптации ЩЖ.
Каноническим корреляционным анализом показано увеличение числа статистически значимых связей как внутри факторов (контроль – 2, группа 1 – 6, группа 2 – 4), так и с другими переменными, не входящими в данный фактор (контроль – 14, группа 1 – 20, группа 2 – 55), что авторы рассматривали как изменение влияния регуляторного звена ЩЖ на функциональные единицы органа при адаптации к продолжительному бегу.