Введение
Коронавирусная болезнь 2019 года (COVID-19, НКИ), вызванная коронавирусом тяжелого острого респираторного синдрома 2-го типа (SARS-CoV-2), возникла в конце 2019 года и быстро переросла в глобальную пандемию, при этом и в настоящее время данное заболевание продолжает вносить значительный вклад в структуру острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ) [1]. По данным обобщенных клинических наблюдений за время пандемии и после нее, НКИ может являться триггером развития или ускорения «естественной истории прогрессирования» хронических заболеваний. Особенно это актуально для сердечно-сосудистой патологии, являющейся ведущей в формировании смертности [2]. Теоретические знания и эмпирические данные объясняют, что данный феномен генетически детерминирован предрасположенностью или типом реагирования макроорганизма на данный инфекционный агент. При этом совокупность событий, возникающих после инфицирования, приводит к изменению профиля экспрессии некоторых генов, что в итоге меняет обмен веществ, нарушает функционирование систем и внутренних органов [3]. С точки зрения возможной коррекции и персонифицированной профилактики заболеваний представляют интерес корреляционные взаимоотношения между течением COVID-19 и нарушениями липидного обмена [4], при этом важным аспектом являются генетические детерминанты взаимозависимости данных процессов.
Такой перспективной мишенью для контроля уровня холестерина в сыворотке крови является пропротеин конвертаза субтилизин/кексин типа 9 (PCSK9). Данная протеиновая конвертаза играет важную роль в обмене холестерина и, в частности, липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) за счет образования связей с рецепторами ЛПНП, что приводит к их дальнейшему разрушению и увеличению уровня ЛПНП в крови [5]. Таким образом, в зависимости от полиморфизма гена PCSK9 может происходить как увеличение ее синтеза, что способствует возникновению гиперхолестеринемии и повышает риски развития сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), так и снижение ее образования, приводящее к протективному эффекту (путем снижения рисков формирования сосудистой патологии). В подтверждение данной гипотезы можно привести данные исследований, где продемонстрирована прямая связь между носительством аллеля G полиморфизма E670G гена PCSK9 и повышенным в связи с этим уровнем PCSK9 с развитием инфаркта миокарда, а также увеличением толщины комплекса интима-медиа сонных артерий и повышенными уровнями липопротеинов и триглицеридов в крови. На основании этих данных можно предполагать, что носительство аллеля G полиморфизма E670G гена PCSK-9 может рассматриваться как один из маркеров высоких рисков развития и неблагоприятного течения ССЗ [6, 7]. В настоящее время свойства PCSK9 и препаратов, ее ингибирующих, еще изучаются. Получены также данные об ее участии в различных физиологических процессах, включая воспаление, регуляцию иммунитета и тромбоз. На основании этого изучаются возможности использования ингибиторов PCSK9 в острой стадии COVID-19 [8, 9].
Известно, что рецептор липопротеинов низкой плотности (LDLR) оказывает значимое влияние на уровень холестерина, а некоторые мутации в генеLDLR, кодирующем его функции, приводят к повышению уровня холестерина и ЛПНП, что может способствовать ускорению атерогенеза и повышению риска развития и прогрессирования ишемической болезни сердца (ИБС) [10].В частности, показана корреляция риска развития ИБС с частотой встречаемости аллеля Т и генотипа ТТ гена LDLR (rs688) [11]. Известно, что рецепторы ЛПНП принимают участие в процессах инвазии в клетку и жизнедеятельности различных вирусов, а последние исследования показывают, что и проникновение вируса SARS-CoV-2 также в первую очередь опосредуется этими рецепторами [12].
Еще одним значимым звеном патогенеза атеросклероза, ИБС и ее осложнений, таких как инфаркт миокарда и хроническая сердечная недостаточность, является металлопротеиназный компонент деградации внеклеточного матрикса [13]. Установлено, что матриксные металлопротеиназы (ММП) могут оказывать неблагоприятное влияние на процессы ремоделирования миокарда. Особенно это касается ММП, экспрессирующихся в миокарде [14]. Как правило, ММП (в том числе МПП-13) в норме синтезируются в тканях суставов и сердце в небольших количествах, при этом их количество возрастает во время заболеваний, сопровождающихся активной воспалительной реакцией, к которым, безусловно, можно отнести и COVID-19 [5]. Хотя ММП-13 играет основную роль в деградации хрящевой ткани, она также участвует в процессах атерогенеза. По данным исследования на популяции больных с остеоартрозом (как вариант хронического воспаления) удалось установить, что вариант полиморфизма ТС (rs2252070) гена ММП-13 ассоциирован со значительным (в 2,7 раза) повышением риска развития гемодинамически значимого атеросклероза, при этом гомозиготный вариант полиморфизма Т гена ММП-13 (rs2252070) характеризовался проективными эффектами [14]. Представленные в статье генетические биомаркеры, хотя и изучались в рамках течения ССЗ, тем не менее, их значение в прогрессировании ССЗ после перенесенной НКИ представляет научный и клинический интерес в связи с некоторой общностью патофизиологических механизмов как ССЗ, так и COVID-19, что определяет необходимость проведения представленного исследования.
Цель исследования
Оценить роль генетических биомаркеров (PCSK9 (E670G), LDLR (rs688), MMP-13 (rs2252070)) в развитии и прогрессировании ССЗ у пациентов, переболевших COVID-19.
Материал и методы исследования
Исследование включало в себя изучение SNP-полиморфизмов генов PCSK9 (E670G), LDLR (rs688), MMP-13 (rs2252070) у пациентов с перенесенным COVID-19 и дальнейшее сравнение полученных результатов с динамикой течения ССЗ до и после COVID-19.
Обследованы 245 человек. По результатам клинического, лабораторного и инструментального исследования пациенты были разделены по течению сердечно-сосудистой патологии после перенесенного COVID-19. Подробная информация по дизайну исследования, критериям включения и исключения пациентов из исследования публиковалась ранее [15].
Для оценки течения сердечно-сосудистой патологии использовались разработанные авторами критерии ее ухудшения, представленные ниже.
Критерии ухудшения
1. Для пациентов с верифицированной ИБС:
· прогрессирование хронической сердечной недостаточности (ХСН) и/или стенокардии напряжения;
· прогрессирование атеросклероза, требующее хирургического лечения;
· впервые возникшие нарушения ритма и проводимости сердца, требующие хирургической или медикаментозной коррекции;
· развитие острых сердечно-сосудистых событий (таких как острый коронарный синдром (ОКС), инфаркт миокарда (ИМ)), не завершившихся летальным исходом.
2. Для пациентов с верифицированными ГБ и атеросклерозом:
· дебют ИБС и развитие ХСН;
· прогрессирование атеросклероза, требующее хирургического лечения;
· впервые возникшие нарушения ритма и проводимости сердца, требующие хирургической или медикаментозной коррекции;
· развитие острых сердечно-сосудистых событий (ОКС, ИМ), не завершившихся летальным исходом.
3. Для пациентов без ССЗ:
· дебют ИБС, ГБ, требующий медицинской коррекции;
· впервые выявленные атеросклеротические изменения;
· впервые возникшие нарушения ритма и проводимости сердца, требующие хирургической или медикаментозной коррекции;
· развитие острых сердечно-сосудистых событий (ОКС, ИМ), не завершившихся летальным исходом [16].
Молекулярно-генетическое исследование
Для проведения молекулярно-генетической части обследования использовали цельную кровь пациентов, включенных в исследование. Для выделения геномной ДНК применяли набор фирмы «Биоламикс» (Россия), экстракцию геномной ДНК осуществляли из лейкоцитов периферической крови.
Последовательность праймеров для идентификации генов была разработана на основе данных библиотеки праймеров UGENE. С помощью твердофазного олигонуклеотидного автоматического ДНК/РНК синтезатора Spectronika H-28 фирмы K&A Laborgeraete (ФРГ) были синтезированы праймеры для определения полиморфных вариантов исследуемых генов, в дальнейшем проводили очистку синтезированных праймеров на системе Р-8 фирмы K&A Laborgeraete (ФРГ).
Таблица 1
Последовательности праймеров для ПЦР
|
Ген (сигнатура полиморфизма) |
Прямой праймер |
Обратный праймер |
|
PCSK9 (E670G) |
5'- GAGATACACGGTTGTGTCCCAA -3' |
3'- TGAGAGAGGGACAAGTCGGAA -5' |
|
LDLR (rs688) |
5'- CGCCTCTACTGGGTTGACT -3' |
3'- CATCTPGGCTYGAGTGATCT -5' |
|
MMP-13 (rs2252070) |
5’-GATACGTTCTTACAGAAGGC-3’ |
3’-ACAAATCATCTTCATCACC-5’ |
Генотипирование ДНК проводили на амплификаторе «ДТ-Прайм» производства ООО «НПОДНК-Технология» (Россия). По результатам генотипирования осуществляли распределение на 3 типа: гетерозигота, аллель 1, аллель 2.
Для обработки и статистического анализа полученных данных использовали программы Microsoft Office Excel 2010 и STATISTICA 10.0. Качественные показатели представлены в виде абсолютных значений с определением их процентного соотношения в подгруппах.
Для определения частоты встречаемости изучаемых генотипов и аллелей использовали четырехпольные таблицы сопряженности с дальнейшим расчетом критерия χ2 (хи-квадрат) Пирсона. В случае значения χ2>8,0 применяли поправку Йетса. Дополнительно проводили сравнение по F-критерию Фишера–Снедекора. Во всех случаях для каждого генотипа (аллеля) выполняли определение отношения шансов (ОШ) и относительного риска (ОР) с определением границ 95%-ного доверительного интервала (ДИ) для каждой функции. Уровень статистической значимости результатов принимали р<0,05.
Проведение исследования одобрено этическим комитетом ФГБ ВОУ ВПО Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова 24 января 2023 года, протокол № 274. Все обследуемые добровольно согласились в нем участвовать, получено их письменное согласие.
Результаты исследования и их обсуждение
На основании критериев ухудшения, по результатам проведенного обследования были сформированы группы с ухудшением или дебютом ССЗ (105 человек) и без признаков ухудшения (140 человек). В таблице 2 представлено распределение полиморфизмов исследуемых генов в зависимости от течения ССЗ после перенесенного COVID-19.
Таблица 2
Распределение генотипов исследуемых полиморфизмов в зависимости от течения ССЗ
|
Генотипы, аллели |
Течение сердечно-сосудистой патологии после перенесенной НКИ |
ОШ (ДИ) |
ОР (ДИ) |
χ2 (p) |
||||||||||
|
с ухудшением (n=105) |
без ухудшения (n=140) |
|||||||||||||
|
Абс. |
% |
Абс. |
% |
|||||||||||
|
PCSK9 (rs505151) |
||||||||||||||
|
AA |
79 |
75,2 |
129 |
92,1 |
0,259 (0,121–0,553) |
0,54 (0,412–0,71) |
12,087 (0,001) |
|||||||
|
AG |
20 |
19,0 |
9 |
6,4 |
3,425 (1,489–7,876) |
1,753 (1,305–2,354) |
7,986 (0,005) |
|||||||
|
GG |
6 |
5,7 |
2 |
1,4 |
4,182 (0,827‒21,153) |
1,175 (1,171‒2,753) |
3,489 (0,063) |
|||||||
|
A |
178 |
84,8 |
267 |
95,4 |
0,271 (0,138‒0,530) |
0,563 (0,452–0,7) |
16,297 (0,001) |
|||||||
|
G |
32 |
15,2 |
13 |
4,6 |
3,692 (1,886‒7,230) |
2,077 (1,305‒3,305) |
|
|||||||
|
LDLR (rs688) |
||||||||||||||
|
CC |
38 |
36,2 |
62 |
44,3 |
0,714 (0,425–1,199) |
0,817 (0,597–1,119) |
1,628 (0,203) |
|||||||
|
CT |
39 |
37,1 |
65 |
46,4 |
0,727 (0,435–1,216) |
0,813 (0,611–1,126) |
2,118 (0,146) |
|||||||
|
TT |
28 |
26,7 |
13 |
9,3 |
3,552 (1,736–7,270) |
1,809 (1,377‒2,377) |
11,791 (0,001) |
|||||||
|
С |
115 |
54,8 |
189 |
67,5 |
0,583 (0,403‒0,843) |
0,811 (0,7–0,94) |
7,736 (0,006) |
|||||||
|
Т |
95 |
45,2 |
91 |
32,5 |
1,716 (1,186‒2,482) |
1,35 (1,104‒1,651) |
||||||||
|
MMP13 (rs2252070) |
||||||||||||||
|
TT |
38 |
36,2 |
79 |
56,4 |
0,438 (0,26–0,736) |
0,62 (0,455–0,845) |
9,055 (0,003) |
|||||||
|
TC |
57 |
54,3 |
53 |
37,9 |
1,949 (1,16–3,259) |
1,457 (1,091–1,948) |
6,546 (0,011) |
|||||||
|
CC |
10 |
9,5 |
8 |
5,7 |
1,737 (0,661–4,565) |
1,327 (0,854‒2,063) |
1,279 (0,259) |
|||||||
|
T |
133 |
84,8 |
211 |
95,4 |
0,565 (0,382‒0,835) |
0,733 (0,598‒0,898) |
7,729 (0,006) |
|||||||
|
C |
77 |
15,2 |
69 |
4,6 |
1,77 (1,198‒2.617) |
1,364 (1,113‒1,671) |
||||||||
Изучена встречаемость полиморфизмов изучаемых генов и их аллелей в зависимости от течения ССЗ после COVID-19, проведена оценка относительных шансов и относительного риска ухудшения течения ССЗ.
Получены статистически значимые различия встречаемости прогностически неблагоприятных генотипа AG и носительства аллеля G полиморфизма rs505151 (E670G) гена PCSK9. При этом генотип АА и аллель гена А ассоциированы с протективным влиянием и снижением риска развития, дебюта ССЗ после COVID-19. При изучении полиморфизма гена GG не получено статистически значимых различий между изучаемыми группами обследуемых (p=0,063), что может быть обусловлено относительно малой выборкой больных с носительством данного генотипа.
Генотип TT и носительство аллеля T полиморфизма rs688 гена LDLR ассоциированы с ухудшением течения ССЗ после COVID-19. В случае носительства аллеля С определялась более низкая вероятность ухудшения ССЗ. Носительство генотипов СС, СТ не оказывает статистически значимого влияния на течение сердечно-сосудистой патологии.
Установлено, что генотип ТС и носительство аллеля С по полиморфизму rs2252070 гена MMP13 статистически значимо чаще встречались у больных с ухудшением течения ССЗ после COVID-19. В свою очередь, генотип ТТ и носительство аллеля Т rs2252070 гена MMP13 характеризуются снижением риска ухудшения/дебюта ССЗ после COVID-19.
В дальнейшем, с учетом выявленных генетических биомаркеров, ассоциированных с ухудшением/дебютом ССЗ после COVID-19, провели количественную оценку их влияния на данные риски. Данные представлены в таблице 3.
Таблица 3
Генотипы (аллели), носительство которых увеличивает риск ухудшения или дебюта ССЗ после COVID-19
|
Ген |
Полиморфизм |
Генотип (аллель) |
ОР |
95 % ДИ |
Критический уровень значимости |
|
|
Для критерия χ2 |
Для F-теста |
|||||
|
PCSK9 |
rs505151 |
генотип AG |
1,753 |
1,305–2,354 |
p<0,001 |
p<0,05 |
|
аллель G |
2,077 |
1,305‒3,305 |
p<0,001 |
p<0,05 |
||
|
LDLR |
rs688 |
генотип TT |
1,809 |
1,377‒2,377 |
p<0,001 |
p<0,05 |
|
аллель T |
1,35 |
1,104‒1,651 |
p=0,006 |
p>0,05 |
||
|
MMP13 |
rs2252070 |
генотип TC |
1,457 |
1,091–1,948 |
p=0,011 |
p>0,05 |
|
аллель C |
1,364 |
1,113‒1,671 |
p=0,006 |
p>0,05 |
||
Исходя из полученных данных, можно утверждать, что при носительстве генотипа AG и аллеля G гена PCSK9 (rs505151) у пациентов после COVID-19 относительный риск ухудшения течения ССЗ увеличивается в 1,75 и 2,1 раза соответственно, при носительстве генотипа ТТ и аллеля Т гена LDLR (rs688) – в 1,8 и 1,35 раза, при носительстве генотипа ТС и аллеля С гена MMP13 (rs2252070) мы можем предполагать увеличение риска ухудшения либо дебюта ССЗ в 1,45 и 1,35 раза соответственно.
Необходимо отметить, что в проведенном исследовании представлены лишь несколько генетических биомаркеров, участвующих в процессе атерогенеза. Тем не менее, исходя из полученных результатов, генотипы представленных генов могут быть значимыми предикторами течения ССЗ у пациентов после COVID-19, во многом определяя скорость формирования и течение атерогенеза и ИБС, а COVID-19 может выступать дополнительным фактором данного процесса. В настоящее время опубликован ряд исследований, демонстрирующих общие патофизиологические механизмы развития ССЗ и COVID-19, в основе которых лежат генетические полиморфизмы и их биологические эффекты представленных в исследовании генов PCSK9, LDLR, MMP13. При этом аналогичных представленной в данной публикации работ в доступной медицинской литературе авторам не встречалось. Ограничением данного исследования явилось отсутствие группы сравнения из пациентов, не перенесших COVID-19, что может потребовать дальнейших исследований. Это обусловлено отсутствием в исходной выборке таких больных. В обнаруженных исследованиях данных генов отмечены такие же патологические полиморфизмы, но при этом их вклад в формирование ССЗ значительно разнится. Это, прежде всего, связано со значительными отличиями в изучаемых выборках по этнической группе обследуемых, сопутствующим заболеваниям и т.д. Поэтому прямое сравнение этих данных видится несколько некорректным. Тем не менее, выявление «патологических» полиморфизмов представленных генов у больных после COVID-19 может быть использовано для динамического контроля за рисками прогрессирования ССЗ в постковидном периоде.
К недостаткам данного исследования также можно отнести несколько ограниченный набор генетических биомаркеров. В дальнейшем планируется расширение объема генетического исследования с целью определения наиболее значимых для прогноза ССЗ биомаркеров, актуальных для использования в клинической практике.
Заключение
В проведенном исследовании впервые получены данные, подтверждающие влияние генетических полиморфизмов генов PCSK9 (rs505151), LDLR (rs688), MMP13 (rs2252070) на течение ССЗ у лиц, переболевших COVID-19. При этом различные полиморфизмы данных генов могут быть как предикторами ухудшения ССЗ после COVID-19, так и, наоборот, предполагать снижение рисков развития и прогрессирования сердечно-сосудистой патологии. Таким образом, использование в клинической практике определения включенных в исследование генетических биомаркеров может позволить в совокупности с другими лабораторными и инструментальными исследованиями прогнозировать течение ССЗ у пациентов, перенесших НКИ, и представляет интерес для дальнейших исследований с целью повышения информативности и репрезентативности полученных результатов.