Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Введение. Сальмонеллёзная инфекция - наиболее распространённое заболевание среди инфекционных диарей и является важнейшим зооантропонозным патогеном с преимущественно пищевым путём передачи [1]. В последние годы отмечается тенденция к снижению заболеваемости сальмонеллёзом: в 2022 году данный уровень достиг 17,1 на 100 тыс. населения, в 2023 - 21,45 на 100 тыс. населения, при среднемноголетнем показателе 27,27 на 100 тыс. населения [2; 3]. На заболеваемость сальмонеллёзом оказывает влияние комплекс факторов, таких как нарушение технологий приготовления, хранения и транспортировки готовых пищевых продуктов и полуфабрикатов; смещение вектора пищевых привычек в сторону стрит-фуда; пренебрежение правилами личной гигиены. Всё это значительно повышает риск инфицирования патогенами с возникновением как единичных, разрозненных случаев, так и групповых вспышек. Клиническую же картину, вариант течения, тяжесть, длительность и исходы заболевания определяют особенности иммунологического ответа индивидуума, обусловленные уникальным генетическим кодом, в виде однонуклеотидного полиморфизма генов. В процессе развития инфекционного заболевания бактерии сталкиваются с различными механизмами защиты, и в первую очередь это местный иммунитет в виде секрета слюнных желёз, слизистой оболочки и т.д., являющийся первичным барьером на пути проникновения микроорганизмов. В дальнейшем активное участие в процессе принадлежит факторам врожденного и приобретенного иммунного ответа. Специфические иммуноглобулины класса А, М и G [4] обеспечивают быструю элиминацию сальмонелл и предотвращают развитие заболевания при повторном инфицировании. Если же рассматривать иммунопатогенез с позиции клеточного и гуморального иммунитета, то в случае сальмонеллёза больше интересует вопрос гуморального иммунного ответа и его зависимость от различных вариантов полиморфных генов.

Цель исследования. Определить уровень эффекторных пептидов и влияние полиморфизма гена IL-10 G1082A на индукцию синтеза иммуноглобулинов у пациентов с сальмонеллёзной инфекцией.

Материалы и методы исследования. В исследовании приняли участие пациенты с диагнозом «сальмонеллёзная инфекция, гастроинтестинальная форма, средней степени тяжести», находившиеся на стационарном лечении в Краевой клинической инфекционной больнице г. Читы. Всего обследовано 23 человека, средний возраст 28,3 ± 11,6 года, из них женщин 47,8% (11/23), мужчин 52,2% (12/23); во вторую группу вошли 20 условно здоровых добровольцев в возрасте 23,3±1,4 года.

Критерии отбора:

- возраст 15–55 лет;

- отсутствие другой острой патологии на момент исследования и/или в течение последнего месяца;

- хронические заболевания вне периода обострения, вне стадии декомпенсации;

- отсутствие беременности, периода лактации;

- отсутствие иммунодефицитных состояний, включая ВИЧ-инфекцию.

Комплексное обследование больных включало детальный сбор жалоб, анамнеза заболевания, эпидемиологического анамнеза; физикальные и общеклинические (общий анализ крови, копрограмма) данные. Диагноз «сальмонеллёзная инфекция» у всех пациентов был подтвержден бактериологическим (посев кала на кишечную группу) и/или серологическим (РНГА с определением титра антител в парных сыворотках, с интервалом 10-14 дней и нарастанием титра антител в 4 и более раз) методами.

Определение концентрации иммуноглобулинов класса M, G, секреторного и общего иммуноглобулина A в сыворотке крови проводилось методом твёрдофазного ИФА, с использованием набора реактивов «Вектор-Бест» (г. Новосибирск). Метод основан на твёрдофазном «сэндвич-варианте» иммуноферментного анализа. Специфическими реагентами набора являются: моноклональные антитела, сорбированные на поверхности лунок разборного полистирольного планшета, конъюгат поликлональных антител с биотином и калибровочные образцы.

Определение полиморфизма гена IL-10 G1082A в цельной крови осуществлялось методом ПЦР с использованием праймеров ООО «Литех» (г. С.-Петербург). Анализу подвергалась геномная ДНК, выделенная из лейкоцитов цельной крови с помощью реагента «ДНК-экспресс-кровь», затем проводилась реакция амплификации с двумя парами аллель-специфичных праймеров.

Статистическая обработка полученных данных осуществлялась при помощи электронных программ Microsoft Excel 2010, Statistica 6,0, с определением статистической значимости различий при достигнутом уровне значимости р≤0,05 с использованием критерия Манна–Уитни (U-тест). Результаты представлены как медиана (Ме) с интерквартильным интервалом (25 и 75 персентили). Оценка распределения признаков проводилась с помощью критерия Шапиро-Уилкса W.

В работе с обследуемыми лицами соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki 1964, 2000 ред.).

Результаты исследования и обсуждение. В процессе исследования установлено достоверное повышение концентрации всех групп иммуноглобулинов в сравнении с контрольной группой. Наиболее высокий уровень отмечался у секреторного IgA и составлял 26,34 [22,26-34.14] мг/мл, что в 8,7 раза превышало показатели контроля - 3,04 [2,409-3,58] мг/мл, р≤0,01. Концентрация общего IgA регистрировалась в пределах 5,19 [3,02-8,08] мг/мл, что также выше нормы в 2 раза, контроль - 2,355 [1,674-2,765] мг/мл, р≤0,01 (табл. 1). Иммуноглобулины класса А относятся к первичным факторам защиты слизистой оболочки, а экспрессия IgA преимущественно индуцируется в Пейеровых бляшках. Вдоль желез эпителия сосредоточены В-лимфоциты, продуцирующие IgА, в процессе миграции через эпителиальную клетку IgА приобретают секреторный компонент и становятся секреторными IgА. Данные иммуноглобулины играют важную роль в защите слизистых оболочек от сальмонелл, в частности опсонируя микроорганизмы и препятствуя их прикреплению к эпителию и размножению, что обеспечивает первичную защиту от инвазии патогена, путём его разрушения [4-6]. А так как у всех пациентов сальмонеллёзная инфекция протекала в гастроинтестинальной форме по гастроэнтеритическому или энтеритическому варианту, то такой высокий защитный уровень иммуноглобулинов класса А обоснован и имеет благоприятный прогностический признак на течение и исход заболевания. Низкие показатели IgA способствуют беспрепятственной инвазии возбудителя в энтероциты, длительной циркуляции, стойкому повреждению слизистой и медленной репарации, что в свою очередь может стать ведущим фактором риска развития патологии ЖКТ даже спустя 1-5 лет [7; 8].

У всех пациентов, учитывая, что заболевание имело не осложнённое течение, протекало только с вовлечением в процесс тонкого кишечника и имело среднетяжёлое течение, показатели IgM не превышали 1,5 нормы: 4,75 [2,73-6,81] мг/мл: 3,069 [2,504-3,91] мг/мл соответственно, а IgG фиксировался в пределах 46,57 [33,77-61,23] мг/мл, что в 2,8 раза выше группы контроля, где показатели определялись в границах 16,482 [12,785-22,175] мг/мл, p≤0,01 (табл. 1). Это связано с тем, что в ответ на проникновение сальмонеллы в организм В-лимфоциты секретируют молекулы моментального реагирования – IgM, которые первично блокируют патоген, останавливая процессы воспаления. В дальнейшем В-лимфоциты трансформируются в плазматические клетки и активно синтезируют IgG. IgG являются ключевым моментом в гуморальном звене иммунитета [9], обеспечивая длительную и стойкую защиту от патогена. Следовательно, IgG определяются в более высокой концентрации, позволяя еще длительное время диагностировать сальмонеллёз как перенесенное заболевание в анамнезе. Это имеет значение у определённой группы пациентов, где перенесённый сальмонеллёз может являться триггером иной патологии пищеварительной системы. Например, перенесённый сальмонеллез как причина формирования синдрома раздражённого кишечника или рака толстой кишки у лиц пожилого возраста [8]. Клиническая картина сальмонеллёза у обследованных пациентов имела классический сценарий. Острое начало заболевания с выраженным лихорадочно-интоксикационным синдромом (лихорадка 37,0-39,5 °С, слабость, головная боль, отсутствие аппетита) и синдромом поражения ЖКТ. Первые часы с момента заболевания характеризовались тошнотой, рвотой, отрыжкой. К концу первых суток наблюдалось ухудшение состояния за счет присоединения энтерита (жидкий стул коричнево-зелёного цвета со слизью, зловонный, метеоризм, схваткообразные боли в мезогастральной области). В 26% случаев (6/23) заболевание протекало с развитием эксикоза. Среди всех заболевших в 87% случаях имел место алиментарный путь инфицирования, после употребления мяса кур и яиц, реже молочных продуктов; в 17% инфицирование произошло при контакте с больным сальмонеллёзом.

Таблица 1

Уровень иммуноглобулинов у пациентов с сальмонеллёзной инфекцией

Примечание: p - уровень достоверности в сравнении с группой контроля (непараметрический метод Манна-Уитни - U–критерий; медиана, интерквартильный интервал между 25 и 75 процентилями).

В современной литературе всё больше работ о влиянии полиморфизма генов на индукцию и экспрессию молекул воспаления как врождённого, так и адаптивного иммунитета. Ассоциации возникают в результате того, что различные аллели генов цитокинов различаются по своей иммунной активности или ответной реакции, приводя к последующему влиянию на развитие иммунных эффекторных функций [10]. В природных популяциях генетические изменения в локусах генов цитокинов могут лежать в основе важных различий между индивидуумами, по их иммунным реакциям или устойчивости к патогенам [11]. Опираясь на имеющиеся данные о локализации полиморфного участка G1082A гена IL-10 в промоторной зоне и его влиянии на индукцию гуморального иммунитета [12; 13], авторы оценивали влияние полиморфизма гена IL-10 G1082A на продукцию иммуноглобулинов. Для этого все пациенты распределены в 3 группы, согласно полиморфному варианту: -1082GG, -1082 GA и -1082 AA, где аллель G заведомо является доминантным, а аллель А рецессивным. Но имеются ли преимущества носительства доминантного аллеля и насколько значимы данные полиморфизмы в формировании гуморального ответа? Как видно из таблицы 2, в когорте поступивших на стационарное лечение пациентов преобладали носители генотипа -1082GG, составляя 60,9% (14/23) от общего числа обследуемых, на долю варианта -1082 AA пришлось всего 13% (3/23). При этом, несмотря на доминанту аллеля G, носители рецессивного аллеля А отличались гиперпродукцией IgM и общего IgA. В группах гомозиготного варианта A/A и гетерозиготного варианта G/A синтез IgM был в пределах 4,97 [2,71-7,32] и 5,22 [3,08-7,32] мг/мл, что достоверно выше, чем у доминантного генотипа G/G, где концентрация IgM регистрировалась в рамках 4,62 [2,73-6,81] мг/мл, р≤0,05. Экспрессия общего IgA у носителей аллеля А повышалась до 5,64 [3,6-8,9] мг/мл (-1082 AA) и до 7,44 [3,86-9,46] (-1082 GA) мг/мл в сравнении с 5,186 [3,02-8,08] мг/мл группы -1082GG, р≤0,05. В то же время показатели IgG и секреторного IgA во всех исследуемых группах регистрировались в примерно равных высоких концентрациях (р≥0,05) (табл. 2).

Таблица 2

Уровень иммуноглобулинов у пациентов с сальмонеллёзной инфекцией, носителей полиморфного гена IL-10 G1082A

Примечание: p - уровень достоверности в сравнении с генотипом -1082GG IL-10, (непараметрический метод Манна-Уитни - U–критерий; медиана, интерквартильный интервал между 25 и 75 процентилями).

Таким образом, у обладателей рецессивного аллеля А зарегистрирована сверхнормативная индукция отдельных групп иммуноглобулинов, что, вероятнее всего, возможно рассматривать как преимущественный фактор. Учитывая, что IgM являются «спринтерами» иммунного ответа и отвечают за быструю нейтрализацию бактерий, то, несомненно, их высокая концентрация способствует более быстрому блокированию инфекционного процесса, что в связке с гиперпродукцией IgА способствует более легкому течению заболевания, ослабляя клинические проявления. Именно молекулы IgА обеспечивают местную защиту слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, блокируя адсорбцию сальмонелл к энтероцитам, в результате чего инвазия бактерий становится затруднительной, предотвращается дальнейший каскад воспалительных реакций. Таким образом, несмотря на достоверно высокие показатели гуморального иммунного ответа у пациентов с гастроинтестинальным вариантом сальмонеллёзной инфекции, носители рецессивного аллеля А, очевидно, находятся в более преимущественном положении за счет повышенного уровня синтеза таких иммуноглобулинов, как IgM и IgA. Следовательно, данная группа обладает меньшими рисками развития наиболее тяжелого сценария сальмонеллёзной инфекции, что подтверждается проведённой сравнительной характеристикой клинической картины течения сальмонеллёза. Несмотря на то, что у пациентов с полиморфным вариантом гена IL-10 G1082A не выявлено различий по длительности заболевания, во всех группах заболевание протекало в пределах 10 дней, у носителей генотипа -1082GG отмечался более выраженный лихорадочно-интоксикационный синдром. В среднем температурная кривая фиксировалась в границах 39±0,8°С. Гастроэнтеритический синдром имел классическое течение и проявлялся тошнотой, рвотой, диареей со зловонным запахом, метеоризмом и болями в мезогастральной области. Обращает на себя внимание тот факт, что у обладателей доминантного аллеля G диарея имела большую частоту, до 10-20 раз в сутки, с дальнейшим развитием обезвоживания. Эксикоз регистрировался среди носителей аллеля G в 30% (6/20). В копрограмме присутствуют объективные признаки воспалительного процесса в виде большого количества лейкоцитов и нарушения процессов пристеночного пищеварения (табл. 3).

Таблица 3

Клиническая картина гастроинтестинального варианта сальмонеллёза с учётом полиморфизма гена IL-10 G1082A

В литературе освещено много научных трудов, связанных с изучением полиморфизма гена IL-10 в различных локусах, влиянием вариантов полиморфного гена на индукцию и экспрессию цитокинов, но практически отсутствуют данные о влиянии данного полиморфизма на эффекторные молекулы гуморального звена иммунитета.

Дело в том, что одиночные нуклеотидные полиморфизмы (single nucleotide polymorphism, SNP) с локацией в промоторной зоне G1082A гена IL-10 оказывают разнонаправленное влияние на индукцию противовоспалительного цитокина IL-10, который влияет на пролиферацию В-клеток, стимулируя продукцию иммуноглобулинов. Например, при СКВ продукция иммуноглобулинов В-лимфоцитами в значительной степени зависит от IL-10. Доказана спонтанная продукция in vitro IgM, IgG и IgA мононуклеарными клетками периферической крови от больных СКВ, при стимуляции рекомбинантным IL (rIL)-10 [14; 15]. Занимаясь изучением данного вопроса, авторы могут с уверенностью утверждать, что носительство полиморфных вариантов гена IL-10 G1082A оказывает непосредственное влияние на экспрессию иммуноглобулинов, определяя степень выраженности гуморального звена иммунопатогенеза и, как следствие, выраженность клинической симптоматики и риск развития осложнений.

Заключение. Сальмонеллёзная инфекция, гастроинтестинальная форма, сопровождается высокой экспрессией всех групп иммуноглобулинов, что определяет ограничение и локализацию инфекционного процесса. У больных сальмонеллёзной инфекцией уровень экспрессии эффекторных молекул гуморального иммунитета определяется носительством SNP промоторной зоны G1082A гена IL-10. Выраженность клинической картины взаимосвязана с вариантом полиморфизма гена IL-10 G1082A.